相对定量： ΔΔCT法和相对标准曲线法.pdf

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1、相对定量：相对定量：CT法和相对标准曲线法法和相对标准曲线法 2 定量定量 PCR: 相对基因表达量相对基因表达量 3 目的基因: Plat1 未处理 样本 处理后 样本 示例实验示例实验 问题:样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化? 4 目的基因: Plat1 示例实验示例实验 未处理 样本 处理后 样本 问题:样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化? 5 实验实验流程流程 t=0 t=12 t=24 t=48 对照样本对照样本 time total RNA cDNA total RNA cDNA total RNA cDNA total RNA cDNA 6 Rn Cycle

2、s Ct =23 Ct = 24 Ct = 24 23 = 1 未处理组目的基因 处理组目的基因 目的基因与目的基因与目的基因目的基因的比较的比较 2-Ct =1/2 7 Rn Cycles 未处理组目的基因和内参基因 处理组目的基因和内参基因 如果加入如果加入内参基因内参基因会怎样呢会怎样呢? ? Ct = 24 14 = 10 Ct = 24 Ct =14 Ct = 13 Ct = 23 Ct = 23 13 = 10 2- Ct =1 8 两种相对定量的方法两种相对定量的方法 比较 Ct (Ct) 法 相对标准曲线法 样本间的倍数关系样本间的倍数关系 9 两种方法的区别两种方法的区别?

3、? 已知各个基因的扩增效率 不需要每次都做标准曲线 简单, 经济, 通量较高 每个基因都要做一条标准曲线 准确的扩增效率计算 工作量大, 成本高, 通量较低 比较 Ct (Ct) 法 相对标准曲线法 10 如何选择相对定量的方法？如何选择相对定量的方法？ Template Ct 目的基因 内参基因 A B C D E F G H I J 对应点相减 A-F = Ct1 11 对应点相减对应点相减 Ct 目的基因 内参基因 A B C D H G E J I F A-F = Ct1 B-G = Ct2 C-H = Ct3 D-I = Ct4 E-J = Ct5 Template 如何选择相对定量

4、的方法？如何选择相对定量的方法？ 12 在在ExcelExcel中制作图表中制作图表 Ct1 Ct2 Ct3 Ct4 Ct5 A-F = Ct1 B-G = Ct2 C-H = Ct3 D-I = Ct4 E-J = Ct5 Ct 稀释点 1 2 3 4 5 如何选择相对定量的方法？如何选择相对定量的方法？ 13 根据斜率选择一种定量方法根据斜率选择一种定量方法 比较 Ct (Ct )法 斜率 0.1 相对标准曲线法 斜率 0.1 如何选择相对定量的方法？如何选择相对定量的方法？ 14 相对标准曲线法相对标准曲线法 15 应该稀释什么样品来制作标准曲线应该稀释什么样品来制作标准曲线? ? 任何

5、数量充足，并表达目的基因和内参基因的浓度较高cDNA 只需知道稀释倍数, 不需要知道浓度 养成好的制作标准曲线的习惯 16 每对引物做一条标准曲线每对引物做一条标准曲线 18s Insulin 10,000 1000 100 10 1 10,000 1000 100 10 1 6420.6 4171.4 Ct Relative Quantity Ct Relative Quantity Untreated Ct Treated Ct Untreated Ct 74.6 Treated Ct 202.3 17 针对每对引物制作标准曲线针对每对引物制作标准曲线 cDNA Ct 目的基因 内参基因

6、斜率 = -3.38 斜率 = -3.32 18 计算举例计算举例 Untreated Qavg. Treated Qavg. Insulin 18s 74.6 202.3 6420.6 4171.4 Normalized Q 0.0116 0.0484 选择一个对照样本： 例如, 未处理样本 Reference Reference: 0.0116 0.0116 = 1 Treated Reference: 0.0484 0.0116 = 4.2 表达倍数差异 19 软件计算软件计算 为你计算好所有的倍数关系. 20 Ct 法法 21 Rn Cycles Ct=22 Ct=27 t=12 h

7、Rn Cycles Ct=24 Ct=26 t=24 h Rn Cycles Ct=23 Ct=33 t=48 h Rn Cycles Ct=23 Ct=30 t=0 内参基因 目的基因 Ct法法 22 Ct 法的必要条件法的必要条件 两个基因 (目的基因和内参基因) 必须有 相一致的扩增效率，并尽可能接近 100% ! 23 Ct法如何判断扩增效率一致法如何判断扩增效率一致 同时扩增目的基因和内参基因， 通过 查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确 定扩增效率是否相似。 24 检查指数增长期的曲线之间是否平行检查指数增长期的曲线之间是否平行 内参基因 目的基因 25 Ct法如何确认扩增效率接近

8、法如何确认扩增效率接近100%100% K=-1/log(1+Ex) 每对引物一条标准曲线 26 标准曲线可以帮助判断扩增效率标准曲线可以帮助判断扩增效率 例如, 斜率 -3.3 说明扩增效率接近 100%. 更小的负值 (例如 -3.5)说明扩增效率小于100%. 公式: E = 10(-1/斜率) -1 27 不想每次实验都做标准曲线？不想每次实验都做标准曲线？ 另一个选择: 预先确定每个基因的扩增效率 前提条件 Vs. 误差允许 28 后续实验中采用Ct 法. 6 不想每次实验都做标准曲线？不想每次实验都做标准曲线？ 29 分析时手动输入每个基因的扩增效率 相对定量结果计算就会把每个基因

9、的扩增效率计算进去 不想每次实验都做标准曲线？不想每次实验都做标准曲线？ 30 Ct反应板设置反应板设置 对未知样本的目的基因和内参基因进行定量 (每个样本三个重复) 无模板对照 (NTCs) 污染监测 31 Ct法结果计算法结果计算 步骤步骤 2: 其他和其他和对照样本对照样本比较比较 Ct 处理样本 Ct 对照样本 = Ct 步骤步骤 1: 内参基因内参基因均一化样本差异均一化样本差异 Ct 目的基因 Ct 内参基因= Ct 步骤步骤 3: 使用公式计算使用公式计算 2- Ct 倍数变化倍数变化 = = 32 公式含义公式含义? ? 2 2 C C T T 2 = 循环间扩增产物量的倍数变

10、化 (i.e. PCR扩增产物量倍增) CT = 处理样本和对照样本之间校正过的循环数变化 所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的 基因的倍数变化 33 Ct计算示例计算示例 Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. dCt ddCt 2(-ddCt) 26.1 16.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5.1 -4.3 20 显示出两倍的表达差异. 重复样本平均Ct值 34 Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. dCt ddCt 2(

11、-ddCt) 26.1 16.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5.1 -4.3 20 为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理 Ct计算示例计算示例 35 Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. Ct ddCt 2(-ddCt) 26.1 16.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5.1 -4.3 20 Ct值= Ct目的基因 Ct内参基因 . 为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理 Ct计算示例计算示例 36 为

12、什么为什么Ct值要相减而不是相除值要相减而不是相除? ? Ct 值是指数值, 而不是线性值. 因此, 我们不能直接用 Ct值相除. 用相减来比较Ct值. (例如: 225 220 = 25) 37 接下来接下来, , 选择一个对照样本选择一个对照样本 所有其他样本都要和对照样本进行比较 没有对照样本. . . Untreated: .074 Treated 1: .148 Treated 2: .222 有对照样本. . . Untreated: 1 Treated 1: 2-倍增长 Treated 2: 3-倍增长 /.074 /.074 /.074 38 选择一个对照样本选择一个对照样本

13、Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. Ct Ct 2(-ddCt) 26.1 16.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.7 5.1 -4.3 20 首先, 均一化所有样本 (如：对照样本 对照样本 ). 接着, 所有样本和对照样本进行比较(未知样本 对照样本). 39 Ct倍数计算倍数计算 Untreated Treated 2 Treated 1 Cttarg. Ctnorm. Ct Ct 2(-Ct) 26.1 16.7 9.4 0 1 23.8 16.0 7.8 -1.6 3 22.8 17.

14、7 5.1 -4.3 20 最后计算出倍数关系: 2-Ct 相对定量 (RQ)值 40 还记得开始时的 相对定量 实验吗? 我们来算一下 基因表达变化 41 Sample c-myc Averag e Ct GAPDH Average Ct Ct c-myc - GAPDH Ct Ct treated -Ct untreated Fold difference in c-myc relative to untreated Time 0 30.49 23.63 6.86 0.00 1.0 Time= 12 hr 27.03 22.66 4.37 -2.50 5.6 Time = 24 hr 27

15、.06 23.20 Time = 48 hr 32.83 23.01 3.86 9.82 -3.00 2.96 8.0 0.13 相对定量结果相对定量结果计算计算 42 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 5.6 8.0 1 t = 0t = 0 t = 12 ht = 12 h t = 24 ht = 24 h t = 48 ht = 48 h 0.13 Calibrator t=0 相对定量结果相对定量结果 6 6 7 7 8 8 Gene ExpressionGene Expression 43 软件计算软件计算 为你完成所有的计算为你完成所有的计算! ! 44 Question?