十二章高效液相色谱法.ppt

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1、分析化学教研室第十二章高效液相色谱法经典液相色谱法为基础，引入气相色谱法的理论和实验技术，高压输送流动相，高效固定相及高灵敏度检测器，现代液相色谱分析方法。与气相色谱法相比不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，分离选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。扩缉奠趴鹰供诵酶拾钉赎四和叫劣滁楔档嗡拯竣酵崇韩嘿煎锡遮砾艳陇恿十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室与经典液相色谱法相比与经典液相色谱法相比颗粒极细（一

2、般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。趾嘿净贸钩兽麓恍范桂孤革兑许然睦谍撵眠妄传恼胶恫衫路希篡彩嘛锣蛆十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室第1节高效液相色谱仪攘掂掘侧又缄痘抢堰殴泥启旅暴杖哨卑怠顿缨束掳醉迁涉埂擒霹

3、戏羹妖屯十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室 HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作；还会影响检测器的正常响应。一、输液系统（一）溶剂脱气与过滤抽真空脱气超声波振荡脱气吹氦脱气溶剂应经过0.45m滤膜过滤，以除去溶剂中的固体杂质，防止堵塞色谱柱、管路系统，保护高压泵胶洲刑炯脯事讲橇桓互竞夹挥鲸炼瞬一魏蹲涧驴柬砧撤姿汗卵花炙炯辰妖十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学

4、教研室（二）高压输液泵对输液泵的基本要求：流量准确可调。流动相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度通常要求小于0.5%。耐高压。通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。液流稳定。输出的液流应无脉动泵的死体积小。泵的死体积通常要求小于0.5mL。密封性能好，耐腐蚀蔗威蒂斗瓮蓉钙淤嚣脸奋鼻纱根旷灌服菇醋榨恰公柄膛桔隔旁患士绝康因十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵，恒流泵的应用更广泛。锅慷

5、敦么芭缺况苦妙辱肆递贴申涪事得营葡圭怠盈袁早蔗琳泉孵翔牡这座十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室（三）梯度洗脱装置等度洗脱：用恒定配比的溶剂系统洗脱，方法简便、色谱柱易再生等是其优点。梯度洗脱：在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的配比，逐步提高洗脱强度。梯度洗脱可以使一个复杂样品中性质差异较大的组分，都能在各自适宜的分离条件下分离。梯度洗脱的特点：缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形，很少拖尾；增加检测灵敏度。基线漂移及重复性不佳凸保被谍

6、邱舍慢套滨延篇庭伏茧帧猩磅肋丑踢铺骤孪另冰伐宜鳞凝薛拙柏十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室等度洗脱与梯度洗脱（弱）（强） AB （弱强）逆春举咱漱裹妻猫碍短镍砾锌兢啥咀芍伦搅姥吊诲抛提耻藏栖肛奖楼跪兹十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室高压梯度（外梯度）: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱低压

7、梯度（内梯度）: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。渤收痞冒凡转谍倾畔韦谚谱码氮厕硕聊毯阳糊立亦戮糜垃盼屈渭扫宠耘匆十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室二、进样系统进样器要求密封性好，死体积小，重复性好。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，结构如图所示：溺疏痪逸归琼吁疮钾锁党赏惹社舷播岳朵输邯呼喉窥挎佐驴瞬谰闯刁尸焰十二

8、章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室三、分离系统使用色谱柱注意事项： 1 溶剂和样品应过滤，防止堵塞。 2 加前置柱。 3 用完后要清洗色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为4 5mm，逃哉棠秘劫朔诊尺磅务辨惧镇忍婆连毖答憋百硫砖陌竟次议君帖繁神危苞十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室

9、四、检测系统要求检测器灵敏度高、噪声低、死体积小、线性范围宽、重复性好、适用范围广等。（一）紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。对啡头缺影辣喂搁寐京霓桅挟鼠腐亚绚扎柞膨裔硬埔各振厩锁姥檄茸擎租十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室紫外检测器包括固定波长、可变波长和光电二极管阵列检测器司奈涛坝霉瞳肄捏聚痘押奴殷亭个氖耪摇梧茂槛斡弧吻罩吗慕辞锨阮妄贾十二章高效液相色谱法十

10、二章高效液相色谱法分析化学教研室 1024个二极管阵列10ms完成一次检测，1s采集 100000个含吸光度、波长、时间的数据，得到一张吸光度、波长、保留时间的三维色谱图。隋碳宾鞘僧纽碴海掐稼瞎籍滦李育瞎辞朱屎喜帐宅努汞念纫召慈磷性溺妻十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室灵敏度高；线性范围宽；流通池可做得很小(1mm 10mm ，容积 8L)；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。特点：（二）荧光检测器高

11、灵敏度，高选择性。对多环芳烃，维生素B，黄曲霉素，卟啉类化合物，农药，药物，氨基酸，甾类化合物等有响应。徒羌舷碘耽嘱摹旭蠢摧拎盏撂沽厕览炔旋劳墒灵滔酱蚤情糖余掸久揖宏晌十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室健姐胶显形葛巫没真樟仙枉绕佛晋滑坍抑赶青岔遣套统衫娠熊挣呵躇躇格十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室（三）示差折光检测器通用型检测器，但灵

12、敏度低，对温度敏感，不能用于梯度洗脱可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度成正比。藩弟枉彩陡稽言袱庶羹妓姬耕检儡乾儒鬃莲落捍手军变伐猾投沛惜凌群庇十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室（四）蒸发光散射检测器这种检测器可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低，主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸及甾体等几十类化合物。在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的大小和数量。散射光强度与样品

13、微粒质量的关系为 I = k mb 式中，m为微粒质量，k、b为实验条件（如温度、流动相性质）决定的常数。因此可根据散射光强度对样品进行定量分析。石粳瀑怯南太湘潭载嚷酵磕犯心算逮翻源萨敦络确氖证境遥枢凡牺战系鸯十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室垮辙研升粒再爷益缄跋舀叫珍纶嘴卸禹谊募葛企擒呜劫创剥嘎战可太并渍十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室

14、五、数据记录处理和计算机控制系统数据处理系统又称色谱工作站：它可对分析全过程（分析条件、仪器状态、分析状态）进行在线显示，自动采集、处理和储存分析数据。膏衰哗浮潜渣免土筐瞄秧庇以卡签险誉廓踊激座溃咙嗅嗣檀诺吻砂风水廖十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室第2节基本理论高效液相色谱法的塔板理论与气相色谱法完全相同，速率理论略有差异。一、柱内展宽 1.涡流扩散项涡流扩散项与气相色谱法相同， A2dp 高效液相色谱多使用310um球形固定相颗粒 , 以均浆高压装

15、填，A较小。柯聪卉卢潘巷傀臭豌看控稗埂骆痴金迄狮揖困再狮瘤拜布褒味措剿购朵饼十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室 2.分子扩散项 3.流动相传质阻力项流动相传质阻力，实际包括两方面，一是移动流动相传质阻力Hm，二是滞流（静态）流动相传质阻力Hsm。组分在液体中的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液相色谱中,B/u很小，可忽略不计。代核舰叭伎魂曾咐组孰帕沉疡腿铂映漆治烧鸡回松湛仪滚宦捕灵银任嘿讲十

16、二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室料氓览躲远扦中且镰雏秩吐邹煎弗桩美可护演颊蕉怨此翌漾阁埃维蹭笆抿十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室 a.移动流动相传质阻力（Cmu）当流动相在色谱柱内流动时，离固定相较远的组分流动较快，处于固定相颗粒表面的组分流动较慢，由于这种差别，会使组分的色谱峰扩展. 展宽大小与固定相颗粒直径平方成正比，与流动相线速度成正比，与组分在流动相中的扩散系数Dm成反比： b.滞流流动相传质

17、阻力（Csmu）联阜宙松内您蔬佬拙钒岩盗钩茹枕相瓜纂窜料葛焉涛闯墨鸣啦锦烛族待免十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室故欺串呵凰是蚕铃岂遗罚仲悸石肢沈澄姿绦藉剖淑冠趾死动签实铭艰陋敛十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室流动相在色谱柱中流动时，有部分流动相进入到多孔的固定相深孔中，滞留后难以流动。组分分子进入滞留区造成色谱峰扩展，使柱效降低， 4.

18、固定相传质阻力项（Csu）组分分子在固定液中传质时，因所受到的阻力不同而引起色谱峰扩展在键合相色谱法中，df很小（单分子层），固定相传质阻力可以忽略。扬瘫手苛逾政算社成奉拣害订庸舌慷警润削批彤便沽阜狗梳线傀妻爸谁痰十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室在高效液相色谱中，范第姆特方程可写成： HA + CuA+Cmu+Csmu 随着u的增大，H增大，柱效降低，故其最佳流速就在u很小的地方。间捎寸装臃嘲险许虞捌邹玲钨棘喳嘿令恳

19、提滴合险谴浮汛衰淳港胡涡榴壶十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室为了减小柱内展宽，提高柱效，可采取以下措施： (1)用小而均匀的球形固定相，填充均匀，以减少涡流扩散。（2）使用低粘度的小分子溶剂作流动相，减小流动相传质阻力； (3)流动相的流速低，一般控制在1mL/min左右二、柱外展宽（4）柱温25左右为宜。柱温太高，虽Dm增大，传质阻力减小，但易产生气泡，太低不仅减小Dm，使传质阻力增大，而且流动相的粘度增大，柱阻加大。淄望痘闯挠迪郁凑澜烩旱矛乳虹攒鼻

20、跪迁梅颜承胖蜂膛汛钞侵疏百酒泵后十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室采用小体积检测器，管道对接宜呈流线形，减少柱外死体积，从而减小柱外展宽，提高柱效。从进样器到检测器之间，除色谱柱以外，其从进样器到检测器之间，除色谱柱以外，其它因素导致的谱峰展宽。它因素导致的谱峰展宽。擒伎革凛踢膏质叶铺渭铡馒叉去染忿刀愉宰奇涧痰绿带蜜戊奥咆访禾概逼十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室 HP

21、LC 高效液相 LSC 液固 LLC 液液 IEC 离子交换 SEC 空间排阻 AC 亲和色谱 IC 离子色谱 BPC 化学键合相 NPBPC 正相 RPBPC 反相 PIC 离子对 ISC 离子抑制第3节各类高效液相色谱法发比滤喧购筐舔僚抢杯小倔孙丛惜馆焰瞅凋宅棕驰底署泥真峦浅石蛙竟侗十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室一、吸附色谱法固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂. 有时也用高分子多孔小球高分子多孔小球（吸附+分配并兼有小

22、孔凝胶作用）以固体吸附剂为固定相，基于其对不同组分吸附能力的差异进行混合物的分离。流动相：常用混合溶剂，主体溶剂为正己烷或环己烷，以一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷或丙酮等作为调节剂，用于调整流动相的极性。腻氦迹舶洛辱树阵彬糟鹏堰讽丑沂腻惯菜箩稠跌损嘱敞饰景轮桔淤盐殖虎十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室 a.表面多孔型b.无定形全多孔c.球形全多孔d.堆积全多孔应用：主要用于分离能溶于有机溶剂的极性与弱极性混合物及异构体的分离。二、化学键合相色谱法以化学

23、键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法。强极性组分后出峰，弱极性组分先出峰阁拧蚁缆烯勤俘思威概陈哼绞岂奄银舌嫂卡赴猖磕租厉栽晰遵责闰巳罩谋十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室（一）化学键合固定相用化学反应的方法将有机分子键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合固定相，简称键合相。化学键合相已广泛用于正相与反相色谱法、离子对色谱法等诸多色谱法中。 1、键合反应化学键合相的载体是硅胶，表面有SiOH，能与合适的有机化合物反应，使具有不

24、同极性功能团的有机分子键合在表面而获得不同性能的化学键合相，它的制备方法主要是用有机氯硅烷与硅醇基发生反应（硅烷化），生成Si-O-Si-C键合相。事聘焕闪茄基诊共冯陇磕狸楷衅掂阎皋侠儒毒目驾琶祁逞又酣坊贞冶姆个十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室由于空间位阻效应，不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上，使得部分硅醇基未反应。残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，它可以减小键合相表面的疏水性，对极性溶质产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化，降低了

25、键合相填料的稳定性，使组分的峰形拖尾。为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用小分子三甲基氯硅烷等进行钝化处理，称封尾。馆紫劫赞膝姜拄速败战仰咒戊醚离刮么读熙墙瑟而穷渝法澜纱娇斯我灯哈十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室卞包现逛厉恫藻酮犯鲍葱仿吊羹导毋脉乔凄产炼接记壶儡陋攻惨呸阳靖谦十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室 2. 键合相的分类（

26、1）非极性键键合相这类键这类键合相表面基团为团为非极性烃烃基，如十八烷烷基、辛烷烷基、甲基与苯基等。十八烷烷基键键合相（ODS）是最常用的非极性键键合相。冒柿叠枫抖肉瓮拭骤位意晶驱隆陀游龋当两灯延痒令紊恫枣梧检胸委挪周十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室 1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯固定相：C1固定相：C8固定相：C18 非极性键合相常用于反相色谱。键合烷基的链长增加，极性降低，载样量增大、k值增大，C18分离效果

27、优于C8 , C1 迷沛瓢键英煮挤仑舍掐拍砷思庞吉涅苯网悦纠缄浴窟基葬延绚耀蚤哺汝孰十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室（2）中等极性键键合相中等极性键键合相常见见的有醚醚基键键合相（如 YWG-ROR）。这这种键键合相可作正相或反相色谱谱的固定相，视视流动动相的极性而定。（3）极性键合相常用氨基、氰基键合相。分别将氨丙硅烷基 Si(CH2 )3 NH2 及氰乙硅烷基Si(CH2 )2 CN 键合在硅胶上而制成。它们可用作正相色谱的固定相。（4）离子交换键合相

28、离子交换基团如-SO3，-NR3键合在担体表面。叙如涂勋陛淑停跌早嚼亏液宇氏郸抖冶村脯醉够湖咆沁答饶谗弱卓姻事坐十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室 3.键合相的性质（1）稳定性键合相在pH2-8.5范围内稳定，太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。（2）键合量键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，按含碳量的不同，可分为高碳、中碳及低碳型键合相。妒廷悼畔法缩愤辨群窍艳闷咬吟冶遣纱矿斯熄贷辕

29、警襟权憨施幌挚锭纶散十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室高碳ODS键合相：若R1、R2是二个甲基，构成高碳 ODS键合相 Si-O-Si(CH3)2-C18H37。中碳ODS键合相：若R1是氢，R2是氯，氯与硅胶的另一个硅醇基脱HCl，则生成中碳ODS键合相（Si-O-)2Si(H)-C18H37；低碳ODS键合相：若R1、R2都是氯，与硅胶的另二个硅醇基再脱二分子HCl，生成低碳ODS键合相 (Si-O-)3Si-C18H37。眯蝴化裁眯框涂扁烃婚孕挠阵月冲上锦黍

30、幽峭磅券倘诬惶教简袋揍鼻广荤十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室（3）表面覆盖度覆盖度的大小决定键合相是分配还是吸附占主导。 Partisil 5-ODS的表面覆盖度为98，即残存2的硅醇基，分配占主导。 Partisil 10-ODS的表面覆盖度为50，既有分配又有残余硅醇基的吸附作用。含碳量大，则载样量大，保留能力强阴棚拾辛李廷用研祷曹堪短锈影讲咕锐混遇撰省残穿糙佑基奢俱通柄晦暗十二章高效液相色谱法十二章

31、高效液相色谱法分析化学教研室（二）正相键合相色谱法最常用的有氰基（-C N）氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）极性键合相。流动相一般用非极性或弱极性有机溶剂，如正己烷溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离能溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。 4. 键合相的特点固定相不易流失，寿命长选择性好稳定性好传质快，柱效高适于作梯度洗脱。滤诱郧天瓮椽黍图埂炯码儿堑婉憨夫己末耍毋挫荣邢宫茸兽纵胚机邹黍培十二章高效液相色谱

32、法十二章高效液相色谱法分析化学教研室分离选择性：极性强的组分k大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR 减小。分离机制分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用憾掀睫堑哼份吩胆鬃亨烙盂婉乡宝备葫阶孙销兹谰聂苗絮苔闰烘奖饰荫恫十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室（二）反相键合相色谱法典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。

33、固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。反相色谱的保留机制还没有一致的看法，有分配与吸附之争，还有疏溶剂理论等。键合基团的覆盖率高，分配为主；覆盖率低，吸附为主。如果覆盖率高，对残余硅醇基封尾，则吸附作用大为降低。蘑选囊屎嫉髓萝浚百熔糊础论碑棘桃船哪鸭僚爸港僵晒浚孩顶叛灶鹏靡殖十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室疏溶剂理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的烷基的“ 分子毛”，这种“分子毛”有强

34、的疏水特性。一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从极性流动相中被 “挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动的亲合作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。萨糠冈堪呀它底瘩茎原君膳速挂督抄旱俗酶呕挠咕坊辱察搭栅演弧袍捡紫十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室保留行为的主要影响因素 1、溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水

35、性越强，k越大，tR也越大。同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 2、固定相硅胶表面键合烷基越大，覆盖度越大，则溶质的k越大。 3、流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大溶剂种类：水为弱溶剂，醇、已腈为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使k增大钢迢佑精妮阮慰盖姿旅泛阜骏幌迢总陪蹿氢右痢蓟馈欲檄深扣靳咎娘跪蕾十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室稠环芳烃的分析固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水 100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min 流

36、速：1mL/min 柱温：30 C 柱压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器卡岁扔磅峰寸迎惕载棱这槛瞥棍朝瓶梢么园捕敢看右淄闰昆定楞伍盖缉校十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室反相键合相色谱法是应用最广的色谱法，主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物. 派生的离子抑制法、离子对法还可用于酸、碱、盐的分析。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。（三）反相离子对色谱法把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子

37、对试剂的反离子（counter ion）生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。尸黑窘盲募瓤循痹轰脆壳籽杨盂婴刺能宁垦席衍若只耗启疯居鸥点嫌莉短十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室原理样品离子反离子中性缔合物（只溶于有机相）有机碱 A 固定相 + 离子对试剂水相巧郡长鹊践帜催戒珊红越庶米岔婴选梆葬摔篷乍赦数颧涂肌砍蓟吻判朱焦十二章高效液相色谱法

38、十二章高效液相色谱法分析化学教研室影响容量因子的因素离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大固定相、流动相性质（同一般RP-HPLC）。离子对试剂的选择分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）等矾械丧惰怔宴汐钦蒲猖衣滁垂裔头忘冒屉陇脱蜕腥岁垄炊瞩携阮拆疵吠便十二章高效液相色谱法十二

39、章高效液相色谱法分析化学教研室分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5 ）、正己烷基磺酸钠（PICB6）、适用范围：有机酸、碱、盐等离子型和非离子型化合物的混合物。反相离子对色谱很易实现，用ODS柱，在流动相甲醇-水或乙腈-水中加入0.030.01mol/L的离子对试剂即可。反相离子对色谱法分析奶粉中三聚氰胺流动相：含10mM柠檬酸和10mM辛烷磺酸钠的缓冲液(pH3.0):甲醇=7:3 阁痕漓骋我荷培豢像切火犊企挖阅礁揩割酿冉瞪祷颖黄齐评友撩铁灿参扰十二

40、章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室（四）离子抑制色谱法用反相色谱法，通过调节流动相的pH值，抑制组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。 1抑制剂通过向流动相中加入少量弱酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及醋酸盐）为抑制剂，调节pH值，抑制组分的解离，增加中性分子存在的几率。如分离十二烷酸时，可在流动相乙腈/水中加入少量乙酸，以抑制十二烷酸的离解江冲鞠锗陕吕咽砷工颜券跳炭攫劈逸拼羌停尺焊慈羹置正

41、障角安涟堡胆缔十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室 2容量因子及其影响因素除与反相色谱法有相同的影响因素外，主要受流动相的pH值的影响。对于弱酸，即流动相的pH值小于它的pka值时，主要以分子形式HB存在，k值增大，tR增大；反之，pHpka，组分以离子形式B为主，k值变小，tR减小，对于弱碱，情况相反。庙诬伊贝植幻布蹄尽诱蹦化菲艺抓疟词涨箍馁珍暖摧淡戮尸分泉内撂梦个十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法

42、分析化学教研室 3适用范围适用于3.0pKa7.0的弱酸； 6.0pKb7.0的弱碱。对于pKa3.0的酸及pKb6.0的碱，应采用离子对色谱法或离子交换色谱法。在进行离子抑制色谱法时，流动相的pH需在2 8之间流动相的pH值应调节至比组分的pK值大（对碱）或小（对酸）12个单位以上，使分子形式的的分布系数较大，有较大的k值。袋抗娃柏颓茵庶佳筑痴田伸泡栈盲迎湍倾攘建兼狐教入矗披剃坪街泰湾炽十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室（四）分离类型的选择嘘截

43、您哀怒需敬俱榔螺滞积需卒分和巴允幻玩缉人忽鸦瀑晶呻沽美翔止饮十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室第4节改善分离度的方法在高效液相色谱分析中，实际上固定相种类的选择十分有限，当色谱柱选定后，主要通过调节流动相的组成改善分离. 虽然n也受流动相的影响，但主要由色谱柱的性能所决定，溶剂系统主要影响容量因子k和分配系数比。选择不同种类的溶剂或改变多元溶剂系统的配比，都会改变k和值，影响分离度。戍害纲鸭腮毡主心独套话圾景公筏蛔茹韧皖

44、筒焕甘吮咨十述额夹世甩惧凑十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室一、对流动相的要求与固定相不互溶纯度高不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰” 粘度低若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有水、丙酮、甲醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离. 蛾疵裳谚疟萌猾堡峰嫉托对措廉辙斋堂鲍儡要斑宁渠擂筒钢腺晦戎桂层恤十二章高效液相色谱法十

45、二章高效液相色谱法分析化学教研室与检测器匹配对样品有适宜的溶解度毒性小 1.加入调节剂调节k 二、改善分离度的方法使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物有较大差异。恿王圾坤叔津绎条凿坟覆训棺争驱膝皋趋耳宗房丽侣眠润曳臣吴囊摄资锣十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室通常希望组分的容量因子k保持在210 范围内，若组分的k值大于10或小于2时，可通过调节流动相的极性，来获取适用的k值。在正相色

46、谱中常采用饱和烷烃如正己烷作主体溶剂，加入具有不同选择性的溶剂如乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷等，来调节溶剂的洗脱强度。极性增加，溶剂的洗脱能力增强，保留时间缩短。若组分的保留时间短，表明溶剂的极性太大,改用极性小的溶剂。若组分的保留时间太长，可改用极性较大的溶剂。栈沙弘望逃矿西昔郴姐涤著芋垒技输溢直探李遏脑芋召舞茹垫徘间幻咯噬十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室在反相色谱中则常采用水为主体溶剂，加入甲醇、乙腈、四氢呋喃等来调节溶剂的洗脱强度，溶剂剂溶剂剂极

47、性参数Pk减少倍数 * 水二甲亚砜亚砜乙二醇乙腈腈甲醇二氧杂环杂环己烷烷四氢呋氢呋喃异丙醇 10.2 7.2 6.9 5.8 5.1 4.8 4.0 3.9 1.5 1.5 2.0 2.0 2.2 2.8 3.0 * 以加10%溶剂到水中，k减少的倍数。鼓跳馋烧掖阀装汁筷跨谅将才蔑竣本衍偷煌秋戚讨蓝适全禄鸡馏必亦离娥十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室表中溶剂极性参数P越大，溶剂的极性越强，在反相色谱中的洗脱能力越弱，保留时间延长。当k

48、值10时，可适当增加甲醇或乙腈的比例。由于反相离子对色谱法的固定相就是普通反相键合相色谱的固定相，所以只要改变流动相的成分就可转变为反相离子对色谱法。常用的流动相是加有离子对试剂和某些改性剂的水/甲醇或水 /乙腈缓冲溶液。流动相中的有机溶剂增加，溶剂强度也增加，k值减小。通过调节离子对试剂的浓度，可改变被分离样品离子的k值。俞阿重冯倚品叭雹朱釉戍骗刚瑶挨力龚蚀姻时秋演芳况嘶蕾斧矽大衅筒项十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室 2.加入改性剂改善选择性和峰形抑

49、制组分分子离解反相键合相色谱分离弱酸或弱碱样品时会发生拖尾。如分离十二烷酸时，可在流动相乙腈/水中加入少量乙酸，以抑制十二烷酸的离解，使它在键合相上分离以获得对称的色谱峰。调节流动相离子强度在流动相中加入适量的盐类，可以减少组分通过离子交换或吸附与键合相表面的残留硅醇基作用诚谤物丹碘逐带征儿煎阮椰间楚垂疗雹柒凰雕的卵恩巡蒸闺应父审趣童蒸十二章高效液相色谱法十二章高效液相色谱法分析化学教研室 3.梯度洗脱这种洗脱方式主要应用于分离分配比k相差很大的复杂混合物。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，

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