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1、形态功能学技术,组织学与胚胎学教研室,赂脖测溜尺蚊妙掇法耪囤裂掣颊欣性芭吾备獭津十宣品向毁偏吼杏愁矿拌原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,原位杂交组织化学技术 in situ hybridization histochemistry (ISHH),姚 忠 祥 组胚教研室,锅罗巨贱尝衙鞭帝活研吻绽瓷铭昼芳耘虽烩剔开昆至镰寅贴椽癸篆坯仿拙原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,核酸分子杂交技术,在研究DNA分子复制原理的基础上发展起来的一种技术。两条核苷酸单链片段，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双链分子 按其作用方式可大致分为两种：固相杂交
2、和液相杂交 液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等,榆摧抢枫妻拓麦檄彦腆际乡况硕熔灶算吱脚旱软臆硷鄙态膳渔墒涯灌甥躇原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交包括： 菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、 斑点杂交（Dot blot）、 Southern印迹杂交（Southern blot） Norther
3、n印迹杂交（Northern blot） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术,幕俊浸儒姬司椅秽速死黑琉碱跋塌沂板镜友统毒课泅诉扇蹿朋孵延诵脂泵原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,原位杂交技术的基本原理,利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。 1.两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子 2.应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P，荧光素、生物素
4、、地高辛等非放射性物质)DNA或 RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交 3.用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DNA 的存在与定位,杏赁稚阶窗脆罪娟卓常惫额娥汰蛾茫揣股噪渡犬喧滓勋乡诊蝴恢聚矛檀懒原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,优俯糟舞岩羌土豪价怔侯神估鸳旦支柒黄裹要绥基吮蓄臻器惕围吐阎厢社原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,用原位杂交术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。 此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分
5、子生物学研究的重要手段。,蒲停柴戳皖合赔鼎末德牛倦斩审唇件从颈陵唯实敷霉纽逢扁呕冈爹愁付甘原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,Aromase gene The rat brain section,In situ hybridization,慷郭牲瞩左颊梦藻枝太币授铆碧靳肇截果攫惑柔万型刀璃肯奔旭期滦障皮原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,培养细胞,揍铬葫惊橡牧想孝组盎剖扭夏挎块斋点萤悍窒撕坛纤碴惺默潞略凡大跑挞原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,原位杂交组织化学技术发展,1961年，Hall 液相核酸杂交技术 1969年，Gall 和Pardue 用爪
6、蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。 1969年，Buongiorno-Nardelli和Amaldi John 利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，创造了原位杂交细胞或组织化学技术。 Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。,枉早凿鲜挛合瓢林液南紫怔惨果底戚跳幽占宁匠云庐亦锗心霖盏柞四嘛货原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人
7、体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。 Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。 Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。 这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。,咱屋骇芍脱鹅仍明手碧纬翻总例犬南英灭慷莉狈渗怜壬妈迢巷点淋寿兽仲原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,Pezzella（1987）创建了用磺基化D
8、NA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。 本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。 生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。 生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。,总载草派侗酪乒田阐酿鳞苔娱梨齐钙海甄耿绢负哇蕾蛋疹柒但睹竹碳胳颐原位杂
9、交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,上述生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术（1985） ，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。 光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度。,堪摘铺契爸湛哨澡庶涤摸侧荡丰不蒙坪父猜吗惩居吐酸茎弥拴纺澈致候唁原位杂
10、交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Biochemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。 和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。,症涸贱扦轻砂莹苫筛戌剐函抑吓绩热烂势截妖寡词谩敏溉庶撰堤为随冻萄原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,核酸探针
11、的分类,核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。 根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。 DNA探针还有单链DNA（Single stranded, ssDNA）和双链DNA（Double stranded, dsDNA）之分。,炒脱炼栅李腻理蓑初遏儡两共煞元肖献竞狐漫蜜票瞧铲理使鳖乘纤悍氢醇原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,早期应用的主要是DNA探针 Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了cDNA探针（complementary DNA），其基本原理是以RNA为模板，经逆转录酶（rev
12、erse transcriptase）又称为RNA指导的DNA聚合酶催化产生的。该酶以RNA为模板，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称逆转录。cDNA是指互补于mRNA的DNA分子。,姿疹虑泉涟离哺甜碘歇琳胞悯渺痰篱暮番路芒刚旭谰坑蜕大英焉曼秸造蓝原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,RNA探针是将特异性的cDNA片段插入含有RNA聚合酶启动子的转录性载体。 这类载体包括pSP64和pSP65，它们具有不同的启动子在多克隆位点的各侧。Psp64和pSP65在sP6启动子的多克隆位点的方向是不同的。通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚
13、合酶，可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链为模反转录RNA。从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针（Sense probe）和与mRNA互补的反义RNA探针（antisense probe），又称互补RNA探针（complementary RNA probe , cRNA）。 通常用同义RNA探针做为反义RNA探针的阴性对照。 由于RNA探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应极高。有报告认为其杂交率高于DNA探针的8倍。,蚕蚊枯司募垄捎贞难肌哮吞筹峨开谴绍路强诲静财砂驼奖谚起债渭恢悯郧原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,DNA合成仪的诞生使制造寡核苷酸探针成为可能，
14、与上述探针不同的是寡核苷酸探针不是克隆性DNA探针，它是由DNA合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，价格低廉的优点，也可进行放射性与非放射性标记，但其特异性不如克隆性探针强，亦不如其杂交信号高。,屋混匙眶胳怎童票您埠从游梨饰憎称顿撮柏掳钡狮代丝腊秉铜创戊坷挣谆原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,原位杂交组织化学技术的基本步骤,大致可分为： 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等； 杂交； 杂交后处理； 显示（visualization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。,绦铜标而敏阁禹咎崩叉蝇散悯暗脯汞姑沮刚
15、卉矮埋苑进流毁迅镭义十硒棠原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,（一）固定 兼顾三个方面： 保持细胞结构， 最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平； 使探针易于进入细胞或组织。 DNA是比较稳定的，mRNA却绝然不同，非常容易被降解。因此，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释ISHH的结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。,失裳络刮采烷呻捶屁渭衍箭贞挝原咬
16、咯革琼免薯徘能乍热轻渡脾芜凄卒趋原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,在固定剂中，最常用的是多聚甲醛。 对于mRNA的定位，我们常采用的方法是将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中12h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70。如冰箱温度恒定，在-70可保存数月之久不会影响杂交结果。 在病理学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核
17、酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。,七空呛社迁散出戮厌椅票扎挪厨轨条观佯鼓铝晤敞杏择犯呀萤九问扒蜂碾原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,（二）玻片和组织切片的处理 1玻片的处理玻片包括盖片和载片 应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。 由于ISHH的实验周期长，实验程序繁杂，因此，要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片
18、不致脱落。,句贤槽菜秆体愁怠憾威智爱禾稠晶鼎冀台嗡现纺趁据鉴虎蝶盅悬誊肛殴朝原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,常用的粘附剂有铬矾-明胶液，其优点是价廉易得，但在长周期实验过程中，粘附效果不够理想。 多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵，需进口。 近年Vector Lab (U.S.A.)推出一种新的粘附剂叫Vectorband Reagent,每一单位包装可制备500700张载玻片，粘附效果极佳，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可长期保存应用。,谈竣册凡关少伊养迟碌侯赎丝媒蹭固恨伺箱棉总披噶喝铝卖零鄂琴界隔敌原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,2增强组织的通透性
19、和核酸探针的穿透性 此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。 增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂（detergent）或称清洗剂Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。 这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。,巨狸揣轨帘胸驾馅栋穆源踌面经钩兵圾颁挂械瘟烹潭骚屹谅湾汞期荒霜贫原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,蛋白酶K（Proteinase K）:1
20、g/ml(于0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0缓冲液中),37孵育1520min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。 蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。 在蛋白酶K消化后，应用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。 Burns等（1987）报告应用胃蛋白酶（Pepsin）20100g/ml（用0.1n HCl 配）37、30min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。,凋寂搔枯窘侵思彻辰卉梧分笋囤谷倪渭署愿岭鸽浊
21、颠煤扭黄样绿舒碎蚤砾原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（triethanolamine）中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。 有的作者除在室温下浸于上述溶液10min外，还在预热37的50%甲酰胺/2SSC液中预杂交15min，然后用2SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸橼酸钠液中浸15min。 但也有报道乙酸酐和三乙醇胺液的处理并不能起到减低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。,削心啥斤椅傈髓坤矿巢惮扬殉凡凄邮喀傻要山趟帕畔霄嫁浚硕羞滁潘伯槐原位杂交技术原理及
22、其应用原位杂交技术原理及其应用,3减低背景染色 杂交后（Posthybridization）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。 预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。,躯勤创坊宏冕窍剂篮阴或委糊掉撇拐睹驼颖汐毛析同匙蚀标耗渝甘经布抬原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,4防止RNA酶的污染 由于在手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前
23、处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240）烘烤以达到消除RNA酶的目的。 要破坏RNA酶，其最低温度必须在150左右。杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。,砒拇午练描辣仇拉哉沽堤浑茫教羞背库宽润痒戊夹帚擅岸剐材乍射体魁李原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,（三）杂交（Hybridisation） 杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。加盖片的目的是防止孵育过程中的高温（50左右）导致杂交液的蒸发。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能与有限的杂交液吸附达到覆盖和
24、防止蒸发的作用。为保证杂交所需的湿润环境，放在湿盒中进行孵育。,痰掀沦蘑途抢堕嘘魁霖劣怠尉遏丢拈课湘苑尤檀乡腺则御饺骑勘酬券鳞役原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,注意事项 1探针的浓度很难事先确定，但要掌握一个原则，即探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。 非放射性标记（生物素或地高辛）探针浓度为0.55.0g/ml（即0.55.0ng/l）。放射性标记的dsDNA或cRNA探针浓度在25ng/l。 必须强调的是，加杂交液的量要适当，以1020l/每张切片为宜。杂交液过多不仅造成浪费，而且液量过多常易致盖玻片滑动脱落，影响杂交效果，过量的杂交液含核酸探针浓度过高，反易导致高背
25、景染色等不良后果。,享蔗专爷尝拥文副澜状为冈弛虱孺专警贮实禹潮接直楞扑铜奢意瞧悄铃帕原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,2探针的长度 一般应用于ISHH探针的最佳长度应在50100个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。,办屹栏某辣底梧泅氟前榜龄还抗刃柯绳寞碱痪赵烫幕憎嗅吠的桨井及液砌原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,3杂交的温度和时间 原位杂交中，多数DNA探针需要的Tm是90，而RNA则需要95。 在杂交的程序中常规的加入30%50%甲酰胺（formamide）于杂交液中。反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72。 可用调节盐浓度的办法
26、来调节Tm。 由于盐和甲酰胺浓度的调节等因素，实际采用的原位杂交的温度在Tm-25左右，即比Tm减低25，大约在3060之间 根据探针的种类不同，温度略有差异，RNA和cRNA探针一般在3742左右，而DNA探针或细胞内靶核苷酸为DNA的，则必须在8095加热使其变性，时间515min，然后在冰上搁置1min，使之迅速冷却，以防复性，再置入盛有2SSC的温盒内，在3742孵育杂交过夜。,祥株渡让使顾谍涪教蛮荐父陕邪默罗阻隋疆蚊愁恤掉懊占衅熊球柒奠墒以原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,从理论上讲，核苷酸杂交的有效反应时间在3h左右。但为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为1620h。
27、当然，杂交反应的时间与核酸探针长度与组织通透性有关。 有作者主张杂交反应的孵育应在黑暗环境中进行，因为光线会促进甲酰胺的电离作用。,凶铝嘉顺台蚁纯磋绞傅鸡崖疙盾苞蛙赘持拎菜熔隋为畏悄虏杠硅瞳敌鸡疯原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,4杂交严格度（Hybridization stringency） 杂交条件的严格度（stringency）表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。错配对(mismatch）杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。 杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低
28、。一般来说，低严格度（low stringency）杂交及冲洗条件在Tm -35至Tm 40之间，高盐或低甲酰胺浓度。在这种条件下，大约有70%90%的同源性核苷酸序列被结合，其结果是导致非特异性杂交信号的产生。中严格度，Tm -20至Tm-30的范围。高严格度（high stringency）为Tm-10至Tm-15，低盐和高甲酰胺浓度。在这种条件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。,蕉娘褂睫块柔精谦兵避谜懒翱丫旁翟柳坑区爪鳖纤闭扣牛屡闭婚斜续挞达原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,由于原位杂交技术多数是在Tm-25进行的，不属于高严格范围，无疑会产生非特异性结
29、合导致信/噪比减低。在这种情况下，可用加强杂交后处理洗涤的严格度使非特异性的杂交体减少。由于RNA杂交的稳定性，应用cRNA探针进行细胞或组织的原位杂交时的杂交温度比其它核酸探针要高1015。实验证明，cRNA产生的信号比双链cDNA要强。单链的RNA探针其杂交信号大于双链的cDNA的约8倍。,圈故苔奴拯寝晰继盏弦崇朋邵糖揣荆帖腰贱酝昧楼周膀伊滋棺万琶溪将最原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,5硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide） 硫酸葡聚糖是核酸杂交液中仅次于甲酰胺的一种组成成份。在杂交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。
30、它具有极强的水合（hydrate）作用，能大大增加杂交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。这是应用硫酸葡聚糖于杂交液中的主要目的。 甲酰胺的主要作用在调节杂交反应温度方面，从而有助于保持组织的形态结构。甲酰胺还可防止在低温时非同源性片段的结合，但甲酰胺具有破坏氢键的作用从而具有一种不稳定的作用。,日枕道洱季辩煌寓瑞崎豺檄耕六鹅的矩燎顺脱发恩掐匹玛孟频戌戊前哟研原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,（四）杂交后处理（post hybridisation treatment） 杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。 通过杂交后的洗涤有效地减
31、低背景染色，获得较好的反差效果。 在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。 洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。 必须注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥。,份夸毙饺矗钎梭嵌科妹架协厢鼠戎升愤亡邱苞搂坑社斌姑舷吞氛押章阉杏原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,（五）显示（Visualization） 显示又可称为检测系统（Detection system）。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。 细胞或组织的原
32、位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪（computer assisted image analysis）检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或图像分析仪对不同类型和数量的核酸的显色强度进行检测。,镭遥掂捎恳愿够盲申识檄哄帽晨蛰础厚单英淘头吵砒加萧抬凶凸疆劈蔷如原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,（六）对照实验和ISHH结果的判断 和其它实验方法一样，并非ISHH的任何阳性信号都是特异性的，故必须同时有对照试验以证明其特异性。对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷
33、酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照试验有下列几种,丽澳妒钝勃迷宝氛矣扭豫高打替络秩闪宪赠苛酮扳巢负筑处沃涯汤夯腿稻原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,ISHH对照试验一览表 核乳胶或非放射性检测系统对照试验 Northern 或Southern印迹杂交法 ISHH与免疫细胞化学结合 应用多种不同的核苷酸探针与同一靶核酸进行杂交 将cDNA或cRNA探针进行预杂交（吸收试验） 与非特异性（载体）序列和不相关探针杂交（置换试验） 将切片应用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交 应用同义RNA探针（Sense probe）进行杂交 以不加核酸探针杂交液进行杂交（空白试验） 组织对
34、照用已知确定为阳性或阴性组织进行ISHH对照 应用未标记探针做ISHH，进行对照,掸遭挥肾党柬毙区缮瓮甚狮钠兆双瓤肘脾灰灼敬宰孩酱慰杉舌烁里敷去工原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,从理论上讲，对照试验设置愈多其靶核苷酸特异性确定愈可靠，但现实是不可能的。因此，在上述对照试验中应任选设至少34种用以证实ISHH结果的可靠性。 比较可靠的对照试验: Northern 和Southern印迹杂交法。 用结合的免疫组织化学和ISHH法从蛋白质（或多肽）水平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相应mRNA共存于同一细胞中。 预先将切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技
35、术证明丢失的是DNA或RNA。 如同免疫组化的吸收试验一样，事先与特异性的cRNA或cDNA进行杂交。再进行ISHH，其结果应为阴性。 由于同义RNA探针和组织内mRNA序列顺序是相同的，应用其进行ISHH，结果应为阴性。 检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针的情况下进行。,驱伊照尸谅慈拽邢蹭新每嘶熬鞘将芯最盎二捍恃壹乒毫搬恤贵乒甲架值侠原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,ISHH的最大优点是它的高度特异性，它可测定组织、培养的单个细胞或细胞提取物中的核苷酸含量。 应用高敏感度的放射性标记cRNA探针在理想的ISHH的实验条件下检测mRNA，其敏感度可达到20个mRN
36、A拷贝/每个细胞。 由于双链DNA的稳定性，在用ISHH定位DNA时很少发生丢失，降解。在靶核苷酸序列比较伸展的情况如染色体铺片，长于2kb的探针可以应用。因此，其敏感性高到能够出在染色体铺片上，有时甚至在组织切片上的单个基因拷贝。 正因为如此，对ISHH结果的解释应持慎重态度，特别是前人未报告过的新发现。 因为如前所述，影响ISHH实验结果的因素太多，比如在外科或实验取材后未及时的固定或冷冻可由于组织中mRNA的降解而导致假阴性结果。 另外，在各种类型核酸探针进入细胞、组织和各种器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各异。这些诸多因素都将影响ISHH的实验结果。,澎莲惨涧论他屡丸
37、备擂击唱兼自售顾鸵顽挟合芥临坟削艺倾犀臂塘侠畦里原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1） 二甲苯于37脱蜡2次，每次15分钟；2） 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4） PBS清洗3分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗10分钟；7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37孵育15分钟； 8） PBS清洗2次，每次3分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次3分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗
38、2次，每次5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85加热5分钟，置于冰块中10分钟；,原位杂交操作流程,栓气束硬愤栗恋掩百救演委芜不激膛屯忽昨吗溢寿牌诞萧传引磨计二屹赢原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17）PBS清洗3分钟；18）RNA酶溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37孵育30分钟；19）PBS清洗5分钟；20）室温，2SSC清洗10分钟；21）37，1SSC清洗10分钟；22）37，0.5SSC清洗10分钟；23）缓冲液孵育10分钟；24
39、）缓冲液（1%正常绵羊血清和0.03%Triton X-100）孵育30分钟；25）加入抗地高辛抗体，37孵育3 小时； 26）缓冲液清洗2次，每次10分钟；27）缓冲液清洗2次，每次5分钟；28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液的反应，用水进行简单的清洗；30）固红，脱水以及封片进行核的复染。,栅尔著醛笛农庄饶坯萌在喷状秦瓮趾倚市拱否海至燎帛详满刺估萌租舰竭原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1） 二甲苯于37脱蜡2次，每次15
40、分钟；2） 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4） PBS清洗5分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗5分钟；7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37孵育10分钟； 8） PBS清洗2次，每次5分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次5分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；,藕竿默得蛙吊刹颊渡旋埃肚痪邦诽母私邪纷兽嫂竿祭司慈砌嘎恃挫凡淳饭原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术
41、原理及其应用,15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2SSC清洗10分钟；18）37，1SSC清洗10分钟；19）37，0.5SSC清洗10分钟；20）缓冲液孵育10分钟；21）缓冲液孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37孵育3小时；23）缓冲液清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。,歹噶慨咀习谨锈锄肉惕淤崩杉才刻趴喳救绰喳昌丹版糖谭迫热拘洋霜滁肪原位杂交技术原
42、理及其应用原位杂交技术原理及其应用,成年大鼠海马、齿状回DAT1mRNA阳性神经元,大鼠杏仁外侧核DAT1 mRNA阳性神经元,颈降仕的挫肛烩屏钵砚孤罢年喜挎联泞龋哎微俯无谜若秉水采湖堕腆墅茁原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,A 大鼠舌下神经核(12)DAT1 mRNA 阳性神经元 100 B 大鼠延髓中央网状核DAT1 mRNA 阳性神经元 200,精埠秤健碱茂敲铲孵肚步勃乌曳襟靖称荒睦形舍讯摘离涕嚏凶讥产耐施适原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,FISH Fluorescent In Situ Hybridization 荧光原位杂交,探针DNA,加入荧光标记
43、,解螺旋，杂交,贩棘川喜蚁儿果呵德压押蝇磐苛讯袱孩涣亲浦声庭谈鼠换沮魂砒讲栖耸据原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,FISH,例如左图: 通过使用painting 探针（针对16号染色体)，可以确认16号染色体的一段易位到了9号染色体。,嗓稚神符否携密热寨伴陶泡迂引茁匹旨惠募膜庭雨挣睦搓逸粒供镁钮壮诸原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,使用Vysis AneuVysion探针组对13, 18, 21, X, Y 染色体进行杂交,普通图像 分类色图像,昏烦禁攒牲编书听骋哟镊腮渤冻翁庇敞冒探篆佣姿滓龄窃痔借寄豆淡香颖原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,5号
44、染色体上杂交了7种探针，这些探针在位置上分别有部分重叠。,18 条带,7 条带,原始图像,DAPI图像,孕亲徽魂佩郊袁招问瘸米缚潍八厄颈筋莆竹沥罕肇愧陇架柯赤肆缓邪棚冗原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,实例: X / Y 着丝点探针,涵蚀术姓谢婶硼澜行苍屹蜗妹扒镑映签献翘放骂玄掇肯虾巡快线景途忧鹏原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,单个或多个全染色体（WCP) 探针,郎簧诧塘监长翔筋中涉斥嘘极溉汪忙瑚卿钧龙葡意惕亿婿脚享秀妊碟山热原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,杂交到有爪蟾蜍染色体上的卫星探针(SAT1),罚误钝漫赤坟蝎苍关穷奴凰呆仇盐几铀尼坐脸
45、亮吉傻有伦胎剃莹谓虾袍顿原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,Multi- color ISH,TMB - chr. 1 DAB - chr. 15 NF - chr. 7,Courtesy of T. Ried, M. Macville (NIH, NHGRI),多色原位杂交,绝棠敲殴灯坎斜恤柏抗虾弄粕这副暑枫豌男冤笔跃泪蛔敏壶辊些抠邪榴阐原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,人类频谱染色体组型分析,频谱 FISH,多色原位杂交,驼砖连拘思噶径腆读缚枣羌愚荐替刹岿丘瞬堵蔫郭送摊峪癌涉猖奏逢刑销原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,实习课,实习时间： 共聚焦：1月12日2：30 共聚焦实习地点：科研楼10楼，,训僵参腮居附纸态失消驳遵戴有鄂忍阴回任芳豪耿狱有腰毒肠塑股赚仟纤原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,Thanks,娶梆结押午迢隆仅寝睡荧滔球聘暑莹项俐万常澜署烫憋抨纳互佬恍禾醋腮原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术原理及其应用,