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1、质粒提取和限制性内切酶消化,目 的,巩固质粒的概念，通过原理部分的学习加深对质粒DNA与染色体DNA理化性质差异的认识 学习碱裂解法提取质粒DNA的方法 掌握酶切反应的操作,质 粒 提 取,质粒是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 是进行DNA重组的常用载体。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型主要为抗生素抗性。,质 粒,Ampr抗性基因,Ampr抗性基因编码一种周质酶（-内酰胺酶）可特异地切割Amp的-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力,常 用 质 粒 提 取 方 法,煮沸法 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直
2、接进行煮沸法提取质粒DNA。提取的质粒DNA中会含有RNA。 碱裂解法,碱裂解法提取原理,宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异,加入碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开,当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子。,由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。,收菌 重悬 裂解 中和 过柱 洗涤 洗脱,质粒提取试剂盒操作步骤,P1: 50mM葡萄糖，25mMTris-HCl, 10mM EDTA pH8.0 P2: 0.2MNaOH,1%SDS P3: 3M醋酸钾, 2M醋酸,硅
3、基质膜在高盐低pH值（pH7.5）时可结合DNA，在低盐及高pH值（pH8）条件下洗脱。,75%乙醇,对数生长后期,取菌液 12,000rpm离心2min 弃上清（尽可能吸尽上清）,用250uLPI重悬菌体沉淀，漩涡振荡至彻底悬浮,加入250uLP2，温和地上下颠倒6 -10次 (溶液粘稠清亮),加入350uLN3, 立即温和上下翻转6 -10次（白色絮状沉淀） 12,000rpm离心10min,小心吸取上清，加入吸附柱 12,000rpm离心1min 弃滤液,加入700uL buffer PW 12,000rpm 离心1min， 弃滤液,空柱12,000rpm 离心2min， 室温开盖放置3
4、 5 min,加入500uL buffer PW 12,000rpm 离心1min， 弃滤液,吸附柱置于新离心管中，加入50-100uLbuffer EB, 室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集质粒溶液到离心管，-20 保存。,CWBIO,取菌液 12,000rpm离心2min 弃上清（尽可能吸尽上清）,用250uLPI重悬菌体沉淀，漩涡振荡至彻底悬浮,加入250uLP2，温和地上下颠倒6 -10次 (溶液粘稠清亮),加入350uLP3, 立即温和上下翻转6 -10次（白色絮状沉淀） 12,000rpm离心10min,小心吸取裂解上清，加入吸附柱 12,000rpm离心1min 弃滤液,加入500uL buffer PD 12,000rpm 离心1min， 弃滤液,空柱12,000rpm 离心2min， 室温开盖放置3 5 min,加入600uL buffer PW 12,000rpm 离心1min， 弃滤液 （重复一次）,吸附柱置于新离心管中，加入50-100uL洗脱液 EB, 室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集质粒溶液到离心管，-20 保存。,T&G,（500uL 平衡液BL，加入吸附柱 12,000rpm离心1min 弃滤液）,质粒电泳图,开环的双链环状DNA 直线DNA 共价闭环超螺旋DNA,