1、一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农被农作物作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才之后才能被植物利用。能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H2O 1 1、实例：、实例：启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，提供有利于目的菌株生长的条件。
2、求，提供有利于目的菌株生长的条件。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是一是一种在体外将种在体外将少量少量DNADNA大量大量复制复制的技术，此项技术的技术，此项技术要求使用要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNa
3、H2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 42 2、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属属于哪类培养基？于哪类培养基？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 唯一氮源：唯一氮源：尿素尿素选择培养基选择培养基培养基的唯一培养基的唯一氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微的微
4、生物才能分解利用尿素。生物才能分解利用尿素。缺乏缺乏脲酶的微生物由于脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。3 3、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将允许特在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。种类微生物生长的培养基。（1 1）将土壤中的固氮菌分离出来）将土壤中的固氮菌分离出来（2 2）将土壤中
5、自养微生物分离出来）将土壤中自养微生物分离出来举一反三（3 3）筛选出抗青霉素的微生物）筛选出抗青霉素的微生物（4 4）筛选出耐高浓度食盐的微生物）筛选出耐高浓度食盐的微生物1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积（的面积（1 mm1 mm2 2）和高（）和高（0.1 mm0.1 mm）的计数室，在）的计数室，在1 mm1 mm2 2的面积里又被划分成的面积里
6、又被划分成2525个（或个（或1616个）中格，个）中格，每个中格进一步划分成每个中格进一步划分成1616个（或者个（或者2525个）小格，个）小格，但计数室都是由但计数室都是由400400个小格组成。个小格组成。计数室计数室操作：操作：将清洁干燥的血球计数板将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片盖上盖玻片，再将，再将稀稀释的样品滴释的样品滴在计数板上，然后在显微镜下统计在计数板上，然后在显微镜下统计4 45 5个中个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品中所含的细菌数。按下面公式求出每毫升样品中所含的细菌数。计算公
7、式：计算公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数菌数4001000040010000稀释倍数。稀释倍数。1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：缺点：2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）（1
8、1）常用方法：）常用方法：每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平均代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液的体代表涂布平板时所用的稀释液的体积积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。当样品的稀释度足够高时，培养基表当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。多少活菌。（2）原理：）
9、原理：稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。说明设置重复组的重要性。在在设设计计实实验验时时，一一定定要要涂涂布布至至少少3 3个个平平板板，作作为为重重复复组组，才才能能增增强强实实验验的的说说服服力力与与准准确确性性。在在分分析析实实验验结结果果时时，一一定定要要考考虑虑所所设设置置的的重重复复组组的的结结果果是是否否一一致致，结结果果不不一一致致，意意味味着着操操作作有有误误，需需要要重新实验重新实验。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度
10、加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组中非测试是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。信度。对照实验是指对照实验是指除了被测试的条件外，其他条除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足条件的是对照组，未件都相同的实验。满足条件的是对照组，未满足条件的是实验组。满足条件的是实验组。.设置对照：设置对照：判断培养基中是否有杂菌污染：
11、判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（完全培养基（牛肉膏蛋白胨固体培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基）与）与选择培养基选择培养基接种接种后培养观察菌落数目。后培养观察菌落数目。小结：对照组虽然不直接影响结果，但实验结小结：对照组虽然不直接影响结果，但实验结论要有说服力，对照的设置是必不可少的。论要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制
12、的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从富含有机物、潮湿、从富含有机物、潮湿、pH7pH7的土壤中取样。的土壤中取样。先铲去表层土先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。先准备好的信封中。取土
13、样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同，一般，细原因：不同微生物在土壤中
14、含量不同，一般，细菌菌 放线菌放线菌 真菌。真菌。目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计数之间、适于计数的平板。第一次做实验，稀释范围要放宽。的平板。第一次做实验，稀释范围要放宽。三三 样品的稀释样品的稀释.取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300303003030030300的平板，的
15、平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。三重复组三重复组求平均值使求平均值使结果更准确结果更准确最好增加空白对照：最好增加空白对照：排除排
16、除无关变量无关变量的干扰，证明的干扰，证明因变量因变量是由是由自自变量变量引起的。引起的。在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。.微生物的培养与观察微生物的培
17、养与观察关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是鉴定细菌的重要手段。质地等等，都是鉴定细菌的重要手段。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是鉴定细菌的重要手段。质地等等，都是鉴定细菌的重要手段。结果：结果：酚红指示剂变酚红指示剂变_，初步鉴定该细菌能够分解尿素初步鉴定该细菌能够分解尿素 分析：分析：细菌能分解尿素产生细菌能分解尿素产生_，使培养基呈碱性，氨，使培养基呈碱性，氨增加增加pHpH升高，酚红由无色变为升高，酚红由无色变为红色。红色。操作：操作：在以在以_为唯一氮源的培养基中加
18、为唯一氮源的培养基中加入入酚红指示剂酚红指示剂尿素尿素（鉴别培养基）（鉴别培养基）红色红色氨氨三、课题延伸三、课题延伸实验结果的进实验结果的进一步鉴定一步鉴定其他鉴别培养基：其他鉴别培养基：测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到膜放到 伊红美蓝伊红美蓝 培养基培养基上培养，大肠上培养，大肠杆菌杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出水样，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有金属光泽有金属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝琼脂伊红美蓝
19、琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结:1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3
20、能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D 4 4、实验测定链霉素对、实验测定链霉素对3 3种细菌的抗生素效应，用种细菌的抗生素效应，用3 3种细种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画菌在事先准备好的琼脂块平板上画3 3条等长的平行线（条等长的平行线（3 3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于3737条条件下恒温培养件下恒温培养3 3天，结果如图所示。从实验结果分析以天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是下叙述，不正确的是 A A链霉素能阻止结核菌的生长链霉素能阻止结核菌的生长 B B链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效C C链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效 D D链霉素可以用于治疗伤寒病人链霉素可以用于治疗伤寒病人D D
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