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1、 中国医科大学博士学位论文先天性全身终毛增多症的遗传学定位和致病突变研究姓名：李宁申请学位级别：博士专业：细胞生物学指导教师：张学20090401 中文论著摘要是一种非常罕见的疾病，发病率未知，已报道的发病率大约在十亿分之一。其特点是非雄激素依赖性全身性毛发过度生长，且不受性别、年龄和人种限制，也就是人们常说的“狼人综合征”、“毛人”或者“毛孩”现象。从中世纪开始，在不少文学和绘画作品中就有对患者的记载和描绘，可见普通大众和科学家们一样，都对此拥有极其浓厚的兴趣。在达尔文时代，人们认为“毛人”是由的很多种改变都会导致遗传病的发生。近年来科学家们检测到一种新的皋因组变性拇孀贾履承亮棵舾泄襑发生缺
2、失、重复、结构完整性破坏或者通过 材料与方法收集家系，对家系中可能追溯到的家庭成员经知情同意后进行详细表型分析，和 蜓駾测序突变筛查抗凝外周血，送上海生物芯片中心，用照萦缮虾煌笱峁中检索拷贝数变异情况。縋检测基因组拷贝数变异应用实验结果根据患者的临床表现，确定本实验所收集的三个中国汉族家系是典型的常染 在拷贝数变异。縋检测基因组拷贝数变异果相一致，并且拷贝数降低与疾病完全共分离。三个家系共同缺失区域所包括的 和在内的这一区域拷贝数突变是导致该病的致病原因。 英文论著摘要琫 籬 琣瑃瑃 甌 琽 甋 ，琣 ， ； 中文名称岷献T嘶駻亚家族基本局部比对搜索工具先天性全身终毛增多症 聚合酶链反应单核苷
3、酸多态琋，琋 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 普通大众和科学家们一样都对这种奇人轶事十分感兴趣。历史上很多有这种表型在达尔文时代，作为进化论的佐证之一，“毛人”被认为是由猿向人进化分“返祖”患者实际上是因为自身存在一些未知的遗传缺陷而罹患了一种以表现出入类祖先特有表型为特征的遗传病。因此找到导致发病的生物学基础，将有助于科学的解释这一历史悠久的自然之谜。虽然几百年来患者有着极高的知名度，但由于发病率极低，记录在案病案个数寥寥无几。历史文献中总共只记载了例典型的患者，其中例分属于鍪芾奂蚁担个家系表现为常 毛发生长是由一系列复杂的相互作用的遗传和内分泌网络所控制，大部分的毛发增多患者是与
4、激素，尤其是雄激素的分泌不平衡有关。而遗传性多毛症，则与激素无关，表型奇特，全身被覆浓密毛发，一般外显完全，出生即可辨识，可以累积身体的任何部位。通过研究这些极端病例，可以了解进化中发生的重大分子生物学事件，并有可能找到调控毛发生长发育的重要分子机制，对于治疗毛发生长异常的疾病，如秃发等，具有十分重要的意义，因此定位克隆的致病基因具有很高的学术和临床价值。针对单基因遗传病致病基因定位研究的核心是连锁分析，包括针对已知位点的连锁分析和针对未知位点的全基因组范围连锁分析。在全基因组范围内进行的候选基因定位分析属于全基因组扫描。全基因组扫描是通过生物统计学方法计算出住基凶组中每隔一定的距离设立的遗传
5、学标记与特定的生物学性状连锁概率，从而来确定该遗传学标记附近是否存在决定该生物学性状的基因。在此基础上，可以在该区域内进行更精细的基因定位，或以该遗传学标记附近的基因作为候选基因，进一步定位和克隆决定该生物学性状的基因。 材料和方法 主要材料、试剂及配制，配套使用成分约梁作按试剂盒说明书进行。操作按试剂盒说明书进行。 常用数据库网址：畁畁甮：痗痟 蜃镈的提取约梁刑崛檀V馗葱蛄械腜扩增一竢汀 星标记的等位片段按长度从大到小的顺序排列编号，读出每个个体该标记的基因全基因组连锁分析模板全基因组扩增使用片实验 涣治鋈砑篸，提取出来，用进行多点连锁分析担奔扑惴遣问治鯪理图中的连锁区域。 表，号染色体上选
6、用的微卫星标记的引物信息讯一几趓一M一銩一丌 一、常染色体显性遗传先天性全身终毛增多症家系资料男女患病机会均等。据此我们认为这些家系均符合常染色体显性遗传。该家系受后背、四肢更为显著，女性受累个体相对毛发较少。大约半的患者显示出轻度匿图，先天性全身终毛增多症临床表现图示患蚁中一位岁患者【砂贾桓泊罅颗苊：家系 名成员的基因型，对家系成员的等位基因进行分析整理，构建包括、该家系的致病基因不存在共分离现象。用软件对疾病与选择位点之認的两点连锁关系进行分析，参数为为负值，排除连锁。 使用软件根据个体的等位基因型、家系成员间的亲缘关系及孟德尔遗传定律，计算出可能性最大的单体型排列方式。如果该区域有我们所
7、研究家系的致病基因，那么从单体型图来看，所有的病人就应该享有从他们祖先来的相同的单体型排布。从图上看，如果该病与候选区域连锁，所有患者就会继承颜色相同的一条单体型。显然对于藕号染色体上的这几个微卫星标记来说由它们组成的单体型并不符合上述规则。所以从单体型的排布来看，这些微卫星标记附近的染色体区域内应该不包含我们所研究家系的致病基因。成的扩增偏差，分别分四次扩增每一样品，然后混合，定量至，然后进行因芯片，严格按照操作手册进行芯片实验，经过 图珻蚁祃己知致病摹闻候选区单体型分析结果的致病基因与这阿个区域均不存在连锁芙系。全基因组连锁分析韑参数设定为常染色体显性遗传 ，璷图首樯瑁甦连锁分析结果图示：
8、共条常染色体，每个小图为一条染色体，由左侧的个骞系成员的基园型和有号染色体近端粒处，有一个连续那颍畲笾滴连锁。连锁边界是 图蚁祃全基因组连锁分析结果粒妊有个连续荡笥的区域。 稪。将该区域信查的候选基因。精确度。通常来讲这种数据筛选过程在全摹园组范围内是平均分布的但我们注 貉鯯标记籷图龊鹤錍蚁档腖值分析 表，三个家系各微卫罐标记电泳结果的岛蚇值结果。 ，駌薷隧瓣秘强嚣嚣图示：家系中患者之间托享单体型焐，分忻，结论同上。 诘腁、， 在定位过程中，我们使用两点连锁分析的方法，选取的是第二代多态性标记，记的等位基因的个数为不容易得到统计学上的正相关结果，即值。因 传机理中的某些作用因素。相对遗传稳定性
9、：与啾龋琒具有更高的遗传稳定性。资迪肿远治觯阂虼私玈作为遗传标记，在家系连锁分析与基因定位，包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究中都可以发挥巨大的作用。也是目前国际遗传学界研究的重点和热点。我们所使用的基因芯片是公司推出的橇舜覶位点，坏阄实闹形锢砭嗬虢咏骄渚嗍。这些的平均杂合性是闪秸判酒槌桑颐茄似渲械囊徽牛糩基因芯片，共包含，鯯，对家系中的个成员 多位点参数连锁分析的可行性受到两个方面的影响：家系的大小和复杂程度。当增加变垦时汁算时问的增长标记 法的软件不适合计算比较复杂的家系。而基于体湿性遗传是家系的更为常见的遗传模式。可是多年来一直没有明确的定 、是
10、一种非常罕见却又知名度极高的疾病，几百年来一直备受科学界和社会大众关注。但是由于患者十分罕见，有研究价值的家系更是少之又少，对于常染色体显性遗传的致病基因定位研究一直没有突破性进展。高分辨率的基因芯片是近年来刚刚兴起的先进技术，具有快速，高通量，可信度高等优势，但由于价格昂贵一直无法普及。基于基因芯片的连锁分析技术也处于刚刚起步阶段，目前尚无统一的操作流程。在本研究中，我们成功收集到了三个典型中国汉族先天性全身终毛增多症家系。并采用目前先进的基因芯片技术，结合我们自己 先天性全身终毛增多症致病突变研究 珻是指蔚目奖词谋洌迦搿笔椭馗础緇。当某个基因组中，。研究发现，诨蜃橹衅毡榇嬖冢朊个碱基敏感基
11、凶发生缺失、重复或者结构完整性破坏时，就会导致蛙因组疾病的发生 法，而在寡核苷酸为探针的际趸戏蛊鹄吹腟以检测出拷贝数变异，而且可以在全基因组范围内确定基因型，便于进行疾病连，分析。况，且与疾病共分离，这提示其可能的发病机制有关。为了进一步深入研定致病机制。材料和方法抗凝外周血， 来源及产地表，基因相关序列测序引物和反应条件 约梁校炕厥誔定测序反应的个数，小于腏龇从笥则进行双向测序反应。测序结果分析谢蜃镈提片段。跏膊切产物做鯬反应。酶切产物做鯬反应。将軸将标记驮咏灰夯旌希湫院蠹佑谛酒希妫咏。杂后再次加入染液放人信号。经最后一轮洗涤，耄產 得到的觚气杭赴瓽瓵一鍭篢疓久 实验结果三个患者的基因外显子
12、以及部分保守序列的测序结果显示，在我们所检基因芯片对初步处理成木湍総格式文件进行拷贝数分析。应用 软件包中的惴贸隹奖词刺从图上可见三个家系中均在拷贝数降低，且在公司提供的数据库校醇焖鞯礁们虼嬖谝阎5腃。同样山上海交 ：；锰帽谒苄腕竺竺竺图示：纵坐标为标化后芯片数据萨值，横坐标为染色体的物理距离。绿色表示步验证前期实验中检测到该区域的存在拷贝数降低的结果。 域内存在的拷贝数降低，且这种拷贝数降低与疾摘表型完全共分离。家系缺。 ，主要功能是维持脂质稳态。比较基因组研究显示该家族与进化密切相关【结合转运基因属于广泛分布于真核和原核生物守残基。与谋匦韵啾龋琓包含了缒螺旋，包含有大量的不同个哺乳动物裕鯝
13、蚝鯝瓽基冈。每个亚家族的 龈鎏逯杏个人在号染色体存在一个娜笔渲泻橇薃，龈增生和相对头部变大等类似患者的头部特征，但是在有些病例中虽然 因。在小鼠皮肤中抑带活性会导致脱发，而过表达则将导致毛发过度域上发生了重大的结构性改变一定不会影响蚴表达活性。因此需要今后进一步纤维瘤、冠心病、先天性白内障、牛皮癣亢吞逯刂甘等复杂性状疾病着在单基因遗传疾病中的作用还鲜有报道。 生物体偶然出现了祖先的某些性状的遗传现象。在人类，偶然会看到有类似灵长类的表型的个体，如短尾的孩子、多毛的人、多乳头的女子等等，这些现象表明，人类的祖先可能是有尾的、多毛的、多乳头的动物。所以返祖现象也被看做的旧逵庠卧咏定量 连接探针扩增
14、星标记处存在缺失，大小约齋芯片实验，我们成功的示 和四个基因。且这种缺失与多毛表型完全共分离。实验和实时定量笛椋岷锨捌诘氖笛榻峁峁灿糜盟闹植煌姆椒芯片全基因组扫描、微卫星标记电泳、比较基因组杂交和荧光实时定量际检测到三个家系患者中的拷贝数降低与疾病表型完全共分离。三个家系共同缺失区域包括彳，蹷碕蜕臼肺四个基因。在国际上首次证实了是一种基因组疾病，并证实了返祖这种现象实际上是遗传缺陷造成的。 共分离，提出并证实是一种基因组疾病。 参考文献：瓺疭 甁：籌 琖珽瓺瓼猻：簃 琑： 瓻猻：琙 珿 琕 ，琣 ：甌瓵：甈：甴甆 依赖性的全身性毛发彰撩蛘咛过度生长，且不受性别，年龄和人种限制。多毛症可以表现为
15、先天性迟发性、全身性局部性、遗传性后天获得性等多种形式。本综述从分子遗传学角度回顾先天性全身终毛增多症的发现，研究历史和相关候选区域定位进展，并为多毛症临床诊断和鉴别提供理论依据。关键词：多毛症返祖现象遗传病一、历史回顾 宫廷，用来娱乐贵族。记录上非常聪明，国传给下一代【弼】。另一个著名的家系是退亩有关【 是报道了虶两个男孩病例，另外还有一个意人利女孩和一个德国女孩二、全身性多毛的表型鉴别及分子遗传学定位研究进展的家系男性成员未受累。症状曾经通过一个无表型的女性成员传递。家系没有牙 显著性多毛伴齿龈增生，呈现显性遗传。毛发和牙龈的发育与性别年龄无必等在年报道了一个鞲缂蚁担眉蚁滴獂连锁显性遗传的
16、先天性广泛性多毛。男性受累重于女性。受累女性表现为非对称性多毛，部分斑块样多毛与旧迨钜恢隆韧粽呓槐浠粢糯个女儿，但并未累及其龆印米酆险骶哂醒丽冈錾谋硇汀治觯現等在年将陔家系的致病基因定位于染色休一旱腄闚 在遗传方式方面，这类疾病通常认为是常染色体隐性遗传。但也有报道为常 甇狹，：、畁畁甮 瓽甁痳瓺：珻，： 甁珺：，：甈 ：瓵琓 一甌琒， 琋狝， ，接收。一籈会议摘要 大力支持。感谢中国医学科学院基础医学研究所孙淼老师对我的指导和帮助。的姜莉老师和附属医院的王振宁老师在科研和工作中的指导和帮助。感谢中国医科大学医学基因组的曹丽华，陈亚男，徐岩，陈红，师秀艳，胡煜，温文，陈晨，鹿蕾娜，石磊，高锦兰，徐影琪，王宇等同学。肿瘤科的徐盈盈，李德明，岳振宇等同学对我的无私支持和帮助感谢中国医学科学院基础医学研究所杨威、赵秀丽老师以及基础所遗传室的许艺明，马芬，卢超霞，温雅然，华芮，刘彦山，齐展同学和生化室崔迎彬同学在生活和科研上热心，无私的帮助。 籍贯辽宁沈阳学士