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1、实验九总糖和还原糖的测定（二） 3,5二硝基水杨酸法一、目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。二、实验原理 :在 NaOH 和丙三醇存在下， 3,5二硝基水杨酸（ DNS ）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的 NaOH 碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm 波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。OH NO 2OH NH 2HOOC+ 还原糖HOOCNO 2NO 2(DNS)（3氨基 5 硝基 水 杨酸 ） ?黄色桔红色三、试剂和器材1、试剂（ 1） 1 mg/ml 葡萄糖标准溶液：准确称
2、取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml ，即含葡萄糖为1.0mg/ml 。（ 2） 3,5 二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5 二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 ml 水中），再加5 g 结晶酚和5 g 亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml 贮于棕色瓶中。（ 3）碘碘化钾溶液：称取 5g 碘， 10g 碘化钾溶于 100ml 蒸馏水中。（ 4） 6N NaOH ：称取 120g NaOH 溶于 500ml 蒸馏水中。（ 5） 0.1% 酚酞指示剂。（ 6）
3、 6 mol/L HCl 溶液2、材料小麦淀粉或玉米淀粉。3、器材分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。四、操作方法1、葡萄糖标准曲线制作.取 8 支 15mm 180mm 试管，按下表加入1.0mg/ml 葡萄糖标准液和蒸馏水。管号试剂012345678葡萄糖标准液 (ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水 (ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.4水杨酸溶液 (ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5葡萄糖含量 (mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min ，取出后
4、立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml 蒸馏水，摇匀。 =540nm 处测定吸光度以葡萄糖含量（ mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品中还原糖的提取准确称取 0.5g 小麦（淀）粉，放在100ml 烧杯中，先以少量蒸馏水(约 2 ml) 调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀，于 50 恒温水浴中保温20min ，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。3、样品总糖的水解及提取准确称取 0.5g 小麦 (淀 )粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml ，蒸馏水 15ml ，在沸水浴中加热
5、0.5h，取出 1 2 滴置于白瓷板上，加1 滴 I-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入 1 滴酚酞指示剂， 以 6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到 100ml，过滤取滤液 10ml于 100ml 容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000 倍的总糖水解液，用于总糖测定。4、样品中含糖量的测定试剂空白还原糖总糖样品溶液 (ml)01.01.0蒸馏水 (ml)2.01.01.0水杨酸 (ml)1.501.501.50将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml 蒸馏水，摇匀。 =540nm 处测定吸光度样品溶液中还原糖和 总糖.测定后，取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。五、结果处理按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：式中： C还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml ；V还原糖或总糖提取液的总体积，ml；m样品重量， g；1000 mg换算成 g 的系数。思考题1. 比色时为什么要设计空白管？2. 比较费林试剂比色法与 3,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果，这两种方法各有何优点？.