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1、利用免疫共沉淀验证HT036与P311 间的相互作用利用免疫共沉淀验证HT036与 P311 间的相互作用袁顺宗 1,2*, 彭旭 1,2*, 马兵 1,2, 王庆红 1,2, 易绍萱 1,2, 贺伟峰 1,2, 陈希炜1,2, 胡晓红 1,2, 张小容 1,2, 周丽娜 1,2, 罗高兴 1,2, 吴军 1,2( 第三军医大学西南医院 :1 全军烧伤研究所 , 创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,2 疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室, 重庆 400038)提要 : 目的利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白HT036(hypotheticalprotein, HT036)和 P311 间的相互作用。
2、方法构建能在哺乳动物细胞中表达带 HA标签的 HT036融合蛋白 (HA-HT036)的重组载体 pCMV-HA-HT036,经酶切鉴定正确后 , 和表达带 Myc标签的 P311 融合蛋白 (Myc-P311) 的重组真核表达载体pCMV-Myc-p311,单独或者共转染人 293 细胞 , 利用免疫共沉淀技术验证 HT036与P311间的相互作用。结果 构建的重组表达载体 pCMV-HA-HT036经双酶切鉴定正确 , 转染 293 细胞 , 抗 Myc单克隆抗体沉淀 Myc-P311相互作用蛋白复合物后 ,用抗 HA单克隆抗体进行 Western blot 检测 , 可以检测到 HA-H
3、T036的表达。结论 成功构建了 HA-HT036融合蛋白真核表达重组载体 , 在哺乳动物细胞中表达后利用免疫共沉淀技术证实 HT036与 P311 之间存在着相互作用。关键词 : HT036; P311; 载体构建 ; 免疫共沉淀 ; 相互作用中图法分类号 :Q503;Q51;TQ93文献标识码 :AIdentification of interaction between HT036 and P311 by co-immunoprecipitationYUAN Shun-zong1,2,PENG Xu1,2,MA Bing1,2,WANGQing-hong1,2,YIShao-xuan1,
4、2,HEWei-feng1,2,CHEN Xi-wei1,2,HU Xiao-hong1,2,ZHANG Xiao-rong1,2,ZHOU Li-na1,2,LUO Gao-xing1,2,WU Jun1,2(State Key Laboratory ofTrauma,Burns and Combined Injury,Institute ofBurns,SouthwestHospital,Third MilitaryMedicalUniversity,2Chongqing Key Lab forMedical Pro-teomics,Chongqing 400038,China)Abstr
5、act:Objective To explore the interaction betweenHT036(hypotheticalproteinHT036)and P311 by co-immunoprecipitation.Methods HA-tagged fusion protein(HA-HT036)expression vectorwas construc-ted,identified and transfectedinto human embryo kidney 293(HEK293)cells alone orwithMyc-tagged fusion protein(Myc-
6、P311)expression vectorpCMV-Myc-p311. The interaction between P311 andHT036 was detec-ted by co-immunoprecipitation.Results Double restriction enzyme digestion showed that pCMV-HA-HT036 was constructed correctly. When Myc-P311 was immunoprecipitated by anti-Myc antibody,HA-HT036 was identified byWest
7、ern blottingwith anti-HA antibody from immunoprecipitated complex.Conclusion The re-combinantvector pCMV-HA-HT036 was constructed successfully. The interaction between HT036 and P311 could be identified by co-immunoprecipitation after co-expression of pCMV-HA-HT036 and pCMV-Myc-p311.The resultprovid
8、es an importantbasis for further study of theintracellular signal transduction ofP311.Key words:HT036;P311;expression vector construction;co-immunoprecipitation;protein-proteininteractionP311基因是本研究小组利用基因芯片技术从早期增生性瘢痕组织中筛选出的显著高表达的差异基因 1, 同时 Pan 等2 的研究证实 P311 蛋白在创伤愈合早期表达于肌成纤维细胞内 , 并且 P311 基因转染成纤维细胞后能够促
9、进成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞 , 提示 P311 可能在创伤纤维化修复以及增生性瘢痕发生发展过程中起着重要作用 , 故我们将其列为增生性瘢痕相关的新候选蛋白。然而 P311 促成纤维细胞 - 利用免疫共沉淀验证 HT036与 P311 间的相互作用肌成纤维细胞转分化的分子机制尚不清楚 , 因此我们又利用酵母双杂交技术对 P311 的相互作用蛋白进行了初步筛选 , 获得了一个能与 P311 发生相互作用的新蛋白未知蛋白HT0363 。在此基础上 , 为了在活体细胞内进一步证实HT036与 P311 间的相互作用 , 我们分别构建了 P311 的融合蛋白 Myc-P311和 HT036的融合蛋
10、白 HA-HT036的表达载体 pCMV-Myc-p311和 pCMV-HA-HT036,共转染HEK293细胞后 , 利用免疫共沉淀验证 P311与 HT036间是否存在着相互作用。1 材料与方法1. 1菌种、质粒和试剂大肠杆菌 DH5 、含 P311基因序列的重组载体pCMV-Myc-p311和含 HT036编码序列的重组载体 pACT2-HT036均为本研究小组保存试剂。 pCMV-HA载体、Myc单抗和 HA多抗均购自 Clontech 公司 ,HRP标记的羊抗兔 IgG 及化学发光液购自博士德公司 , 细胞裂解液 RIPA 购自 Santa Cruz 公司 , PVDF 膜购自Mil
11、lipore公司 , 蛋白标准品 Biotinylated Protein Ladder)及其检测抗体(Anti-biotinHRP-linked antibody) 购自康成公司 , 分子生物学操作所用工具酶购自 TaKaRa公司 , 质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自 Omega公司 , 胰蛋白胨、酵母提取物购自 Oxford 公司 , 琼脂粉、琼脂糖等购自上海生工 , DMEM购自 Gibco 公司 , 转染剂 Lipofetamine 2000 购自 Invitrogen 公司。1.2方法1.2. 1重组载体 pCMV-HA-HT036的构建分别根据 pACT2-HT036和空载体pCM
12、V-HA的特点 , 进行 Sfi 和 Xho双酶切 ; 0. 6% 琼脂糖凝胶电泳酶切产物后 , 紫外灯下分别切割含目的片段和载体的凝胶 , 用胶回收试剂盒进行回收 ;T4DNA 连接酶分别连接胶回收产物 (16 , 1 h) 并转化连接产物至 DH5, 挑取单菌落进行质粒扩增 , 用 Sfi 和 Xho双酶切鉴定连接产物 , 并用 0. 8% 琼脂糖凝胶电泳酶切产物。 1. 2. 2细胞转染按 2105/ 孔接种 HEK293细胞至六孔板中 , 待细胞长至 90%融合时共转染 pCMV-Myc-p311和 pC-MV-HA-HT036,以 pCMV-Myc-p311 和 pCMV-HA-HT
13、036的分别转染为对照组。具体方法 : 将 10gDNA用250 l 不含抗生素的无菌无血清DMEM稀释并混匀后 , 室温孵育 5 min 。用 240 l 不含抗生素的无菌无血清 DMEM稀释 10l Lipo-fectamine 2000 并混匀后 , 室温孵育 5 min。将和中混合液进行混和即成转染混合液 , 室温孵育 15 min 。将六孔板中培养基换用 1 ml 不含抗生素的无菌无血清 DMEM,加入转染混合液 , 并轻柔混匀 , 置于 CO2培养箱中 (37 , 5% CO2) 孵育。 4 h 后, 弃去培养基 , 换用含10%小牛血清之 DMEM继续培养。1. 2. 3免疫沉淀
14、反应转染 48 h 后, 弃去培养基 , 在冰上进行后续操作。刮下细胞 , 用冷 PBS液冲洗 2 遍, 离心 , 弃上清 , 加入 100 lRIPA, 冰浴 30 min, 加入 1g 小鼠抗 Myc单克隆抗体 , 4 旋转混合 2 h, 加入 20l 蛋白 A, 继续混合12 h, 离心 , 去上清后 , 用 RIPA 洗沉淀 3 遍, 加入 20l 2 Tricine SDS -PAGE上样缓冲液 , 煮沸 5 min, 稍离心后 , 立即进行电泳。1. 2. 4Western blot检测用 10%Tricine SDS-PAGE胶对样品进行电泳 ,每孔上样量为 20,l 蛋白标准品
15、上样量为 10,l 用半干电转仪转膜后 , 5% 脱脂奶粉封闭 1 h, 然后加入 12 000 稀释的兔抗 HA多克隆抗体 , 4 过夜孵育后 , 0. 1% TBST 洗膜 , 3 次, 5 min/ 次 , 加入 110 000 稀释的羊抗兔 IgG 和 110 000 稀释的蛋白标准品检测抗体 , 室温孵育 30 min, 洗膜 , 方法同前 , 根据操作说明 , 加入化学发光液 , 于 Bio-Rad 凝胶成像仪中进行显影。2 结果2. 1重组载体 pCMV-Myc-p311和 pCMV-HA-HT036的鉴定经酶切、电泳后获得的图谱显示 ( 图 1), 近 250 bp 处的条带为
16、酶切后的目的片段 P311 编码基因 ( 图 1, 条带 2), 近 700 bp 处的条带为酶切后的目的基因HT036(图 2, 条带 3), 表明 pCMV-Myc-p311和 pCMV-HA-HT036分别构建成功。实验重复 3 次, 结果均一致。1:DNA标准 (DL2000);2:pCMV-Myc-p311 酶切 ;3:pCMV-HA-HT036酶切图 1 pCMV-M yc-p311和 pCMV-HA-HT036重组载体酶切后的琼脂糖凝胶电泳图2. 2 免疫共沉淀结果pCMV-Myc-p311和 pCMV-HA-HT036共转染 HEK293细胞 48 h 后, 提取蛋白 , 沉淀
17、 P311 及与其相互作用的蛋白复合物 , 并进行 Western blot 检测 ( 图 2) 。从图 2 可以看出 , 在单独转染 pCMV-Myc-p311或 pCMV-HA-HT036的情况下 , 利用Myc抗体进行免疫沉淀后没有检测到 HA-HT036的表达 ( 阴性对照 ), 只有当 pCMV-Myc-p311 和 pCMV-HA-HT036共转染后 , 在经 Myc抗体沉淀下来的 Myc-P311相互作用蛋白复合物中 , 才可以检测到 HA-HT036的表达 , 结合我们前期酵母双杂交的筛选结果 , 表明 P311 与 HT036之间具有相互作用。实验重复3 次, 结果均一致。2
18、4011: 蛋白标准 ;2:pCMV-Myc-p311 单转染 HEK293;3:pCMV-HA-HT036单转染 HEK293;4:pCMV-Myc-p311和 pCMV-HA-HT036共转染 HEK293图 2 免疫共沉淀检测 P311与 HT036之间的相互作用3 讨论从全细胞提取物中利用免疫共沉淀技术来检测蛋白间的相互作用是一种极为有效的检测方法 , 该技术可以用来验证已知蛋白间的相互作用, 还可以用来验证已知蛋白与未知蛋白间的相互作用。免疫共沉淀技术既可以单独使用也可以和其他方法如酵母双杂交技术联合应用来验证蛋白间的相互作用4 。本实验就是在前期的酵母双杂交初步筛选结果的基础上进行
19、的进一步验证P311 与 HT036之间的相互作用。P311,亦称 PTZ17,编码分子量为 8103 的胞内蛋白 , 最初被发现于神经元和肌肉组织中 5 。随后本研究小组发现在早期的增生性瘢痕组织中, P311 基因呈显著差异表达 , 但机制与作用不明。同时 , Pan 等 2 也研究发现创伤愈合过程中 , P311 蛋白高表达于肌成纤维细胞 ( 以细胞质为主 ) 中 , 且能够促进成纤维细胞 - 肌成纤维细胞转分化 , 表明 P311 可能影响纤维化乃至增生性瘢痕的发生发展过程。增生性瘢痕通常由于皮肤创伤不完全修复过程中的过度纤维化所致 , 其产生决定于炎症范围与持续时间、作用于瘢痕组织的
20、张力以及个体遗传表型等因素 6 。既往研究表明成纤维细胞/ 肌成纤维细胞在纤维化发生和瘢痕形成过程中起着关键作用 7, 虽然目前的研究表明 TGF- 1、 PTEN和 PPAR 拮抗剂等因子在成纤维细胞 - 肌成纤维细胞转分化中发挥着重要功能 8-11, 然而对参与其中的调控基因及其信号传导机制还未完全清楚。因此 , P311 的发现及初步研究结果对于揭示增生性瘢痕的发生发展以及防治 , 可能会是一个新的突破口。尽管如此 , 对于 P311 在与增生性瘢痕密切相关的成纤维细胞 - 肌成纤维细胞转分化过程中的细胞信号研究 , 文献报道却较少。虽然我们在前期的研究中获得了一个新的 P311 相互作
21、用候选蛋白未知蛋白 HT036,但由于 P311与 HT036均没有现成的抗体可以获得 , 因此我们采用了真核细胞内表达带标签的融合蛋白Myc-P311和 HA-HT036,并通过免疫共沉淀的方法证实 P311 与 HT036在活体细胞内存在着相互作用。不过 , 对于 P311 与 HT036间的相互作用对肌成纤维细胞转分化的影响尚需进一步实验研究来进行探讨。参考文献 :1 WU J, MA B, YI S,etal. Gene expression of early hypertrophic scar tissue screened bymeans of cDNA microarraysJ.
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