植物组织培养第六章植物细胞培养.ppt

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1、第六章 植物细胞培养,目的与要求 掌握单细胞培养概念，了解单细胞制备途径，掌握单细胞培养繁殖的方法。掌握植物细胞悬浮培养的意义和细胞株筛选方法，了解悬浮培养类型及方法，清楚细胞悬浮培养的应用。 具有单细胞分离和培养基本能力，具备细胞悬浮成批培养和连续培养基础知识。,细胞培养，即通过细胞继代培养，使细胞无限增殖，并使高等植物的单个细胞，在离体培养条件下，通过诱发细胞分裂形成细胞团，再分化形成具根芽的完整植株。,第一节 单细胞培养 一、单细胞培养意义 1、建立单细胞无性系 2、对培养的单细胞科诱发突变 3、排除体细胞干扰 4、遗传转化受体的建立,二、单细胞的分离,叶组织是分离单细胞的最好材料， 1

2、、机械法：叶片组织轻轻研碎，匀浆过滤或离心，得到纯化细胞。 特点：细胞不受酶伤害，不会发生质壁分离。 不适用于所有植物 2、酶解法：利用果胶酶处理叶片，使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞。 特点：必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞胀裂。,三、单细胞培养方法,（一）看护培养法 用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 （1）取处于活跃生长期约1厘米大小愈伤组织块。 （2）无菌条件下，愈伤组织块安放在培养瓶中，在愈伤组织上放约1厘米平方的无菌滤纸片。置培养室中放过夜。 （3）从悬浮培养物或疏松的愈伤组织上分离出单细胞，并把单细胞接种在培养瓶中的滤纸上面。

3、 （4）恒温培养。,（二）微室培养法 人工制造一个小室（载玻片和盖玻片），将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。小室可通过毛细管与外界通气，便于观察。 注意载玻片厚度1mm，微室厚度最好不超过20um，盖玻片厚度在0.17-0.18mm左右，观察效果才好。,（三）平板培养法 平板培养法是把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。,步骤： 1、单细胞悬浮液的制备 2、悬浮细胞密度的调制 3、琼脂培养基的配制 4、平板制作 5、培养,（四）条件培养基：在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这

4、些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。 方法：把液体培养基中培养了4-6周的高密度细胞过滤掉，将其培养基制成液体培养基或固体培养基来培养单细胞或低密度细胞群体，这样可明显提高单细胞培养物存活和分裂的能力。,第二节 细胞悬浮培养,细胞悬浮培养是使离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。建立在愈伤组织的液体培养技术基础上。目前已发展到全自动控制的大容积发酵罐的大规模工业生产的连续培养。为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验系统。,1、愈伤组织诱导 材料自来水冲洗75%的乙醇擦洗将材料切成小块（带形成层）接种到MS+2,4-D 2mg/L+CH 500mg/L+琼脂0.8%,

5、pH5.8的培养基上得愈伤组织扩大繁殖。 2、单细胞悬浮液的制备 愈伤组织转移到液体培养基中4r/min转床培养10d140m140m的细胞筛过筛使细胞密度达到10 个/ml左右得单细胞悬浮液。,在细胞悬浮培养中，采用生长快、有效成分高、适合悬浮培养的细胞株。筛选细胞株的方法是：（1）从培养的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长快的浅色愈伤组织。（2）用振荡或酶法，游离出单个细胞或小细胞团。（3）接种在固体培养基上培养2周。（4）挑选生长快的细胞株并继代培养。（5）取各细胞系的培养物，进行有效成分的测定，筛选出有效成分高而生长较快的细胞株。,一、培养类型和方法,（一）成批培养 指把细胞分数在一定容积

6、的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。,（1）细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的养分为细胞耗尽为止。（2）用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在培养基中的均匀分布。（3）在整个培养过程中，细胞数目会不断发生变化，呈现出明显的慢-快-慢，最后增长停止的细胞生长周期。（4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。,1、成批培养法,细胞生长周期,延滞期,对数增长期,直线生

7、长期,缓慢期,静止期,时间,细胞数目,（二）半连续培养,指每隔一定时间后倒出一半的悬浮液，并同时补充加入等量新鲜培养液。能重复地取得大量、均一的培养细胞，供生物研究之用。,是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。 在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。,（三）连续培养,1、连续培养的特点（1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。（2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。细胞增殖速度快。（3）适于大规模工业化生产。,（三）连续培养,2、连续培养的种类封闭式连续培养：系统中

8、的细胞数目不断增加。开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。,封闭型连续培养：在培养过程中，排除的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生长的需要。 悬浮在排除液中的细胞经机械方法收集后再放回培养系统中，因此在这样培养方式中，随着培养时间延长，细胞密度不断增加。,开放型连续培养：为了不使限制细胞生长的因子出现，创造一个稳定的细胞生长的环境，必须建立一套自动控制系统来调节培养基注入的数量和培养液的总体积。 在开放连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流入和流出的速度，使细胞的生长速

9、度一直保持在一个稳定状态，流出的细胞相当于培养系统中新细胞的增加数。,3、为了保持在开放连续培养中细胞增殖的稳定性，采取的控制方法：（1）浊度恒定法（2）化学恒定法,二、悬浮细胞的继代,在悬浮培养中，为了保持一定的悬浮细胞增殖速度和增殖量，应定期做继代培养，最适的周期一般为1-2周。但实际所需的时间和接种量应视不同细胞系而定。 继代时间为1周的细胞系可用1：4的接种量，继代时间为2周的可用1：10的接种量。,二、悬浮细胞的继代,在悬浮培养中，细胞刚进入静止期之初，细胞悬浮液达到最大量，就必须进行继代培养。因为处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长会引起细胞的大量死亡和解体。 为了加速细胞增殖，有的

10、甚至在对数生长期末就进行继代。,三、培养细胞的同步化,同步培养：在培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段，同步性的程度以百分百分数表示。,三、培养细胞的同步化,实现悬浮培养细胞同步化的方法： 1、饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同时进入分裂。,三、培养细胞的同步化,2、抑制法：使用DNA合成抑制剂，也可使细胞培养同步化。当细胞受到这些化学药物处理后，由于这些核苷酸类似物的存在阻止了DNA的合成，细胞周期只能进行到G1期，细胞都滞留在G1期和S期的边界，当把

11、这些抑制剂除去后，细胞就进入同步分裂。,为了改善液体培养基中材料的通气状况，需进行培养基的不断振荡：（1）旋转培养（2）往返振荡培养（3）旋转振荡培养（4）搅动振荡培养,四、培养基的振荡,1、培养基成分：N6，MS，B5适合单子叶植物细胞，MS，B5，LS，SL适合双子叶植物细胞。条件培养基适合单细胞和低密度细胞培养。需要硝态氮、铵态氮、无机磷浓度更高。,五、影响细胞培养的因素,2、细胞密度：培养基的成分和起始细胞密度对单细胞培养成败有影响。 起始密度：细胞培养最低的有效密度，即能使细胞分裂、增殖的最低接种量，低于这个密度细胞不能分裂，甚至很快解体死亡。,五、影响细胞培养的因素,3、植物生长调

12、节剂：细胞悬浮培养时，常表现一种自然的聚集现象，加入2，4-D，少量水解酶或酵母提取液，能够增加细胞的分散度。,4、PH和二氧化碳浓度 在悬浮培养时，PH变动相当大。加入EDTA使铁和其他金属离子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作为稳定PH的一种方法。 二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中，二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用，,第三节 植物细胞生长和活力的测定,一、悬浮培养中细胞生长的测定 1、细胞计数：把1份培养加入到2份8%三氯化铬溶液中，在70下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震荡10分钟，用血球计数板进行细胞计数。,一、悬浮培养中细胞生长的测

13、定,2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个15ml刻度离心管中，在2000g下离心5min，得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积（PCV）：以每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。 3、细胞鲜重和干重：,4、细胞有丝分裂的指数：在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占细胞总数的百分数。 5、细胞植板率=每个平板形成的细胞团数/每个平板接种的细胞总数,一、悬浮培养中细胞生长的测定,第三节 植物细胞生长和活力的测定,二、培养细胞活力的测定 1、TTC法 2、荧光素二乙酸法（FDA法） 3、伊凡蓝染色法,第四节 植物细胞培养的应用,一、植物次生代谢产物的生产 二、突变体选择 三、诱导多变体

14、,（一）生产天然的植物成分 通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物，如生物碱、 抗菌剂、抗血平、橡胶、类固醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质.,一、植物次生代谢产物的生产,海巴戟的植物体内 蒽醌 胡萝卜愈伤组织 紫红色、橙红色、绿色、黄白色4种愈伤组织株系 紫草 紫草色素 长春花细胞和愈伤组织培养物 利血平和阿马灵 三七的愈伤组织培养物 三七皂苷（含量达干重的10.25%） 三分三的愈伤组织中 茛菪碱（含量可达干重的0.55%,一、植物次生代谢产物的生产,问题： 1.在很多情况下，有些细胞培养物不能产生天然化合物或者比正常的植株产量低 原因：（1）培养细胞与完整植株不同，培养的细胞缺少完整

15、植株 所有的那种进行转化反应的能力 （2）对于能够促成这类天然产物合成的营养条件和其他培养条件缺乏了解 已知：在培养细胞中生物碱的产量受培养物的生长阶段、培养基成分、培养条件（光照、温度）及细胞基因型等的影响。,问题： 2.细胞在遗传上的不稳定性 解决：对能够合成这些化合物的细胞进行不断的筛选，选择那 些稳产和高产的细胞系。,（二）生产转化 定义：利用生物系统通过水解、加氢、羟基化作用、氧化还原及脂化反应，将有机分子转化为新的化合物的过程。 方法：（1）给细胞提供在一般情况下植物所不具备的底物化合物。 目的：得到自然界中不存在的化合物。 （2）给细胞提供植物天然产物中间体。 目的：提高该种天然

16、化合物在细胞中的产量。,（三）细胞的工厂化生产 步骤：（1）高产细胞株的选择 （2）“种子”培养 （3）细胞的规模培养,二、突变体选择 突变体育种缺点：对多细胞有机体进行诱变处理后会形成嵌合体 利用细胞培养进行突变体选择，多采用离体的单倍体细胞，因为它能加强获得隐性突变体的机会。还可以在很小的空间操作千百万潜在的植株。,（1）直接选择法：适用于抗性变异的细胞选择 方法：在培养基中加入某种对正常细胞有毒害的物质，当多数细胞死去以后，把少数能存活的细胞系分离出来，转入含有同种毒素但浓度更高的培养基上，进一步检验这些细胞系的突变性质。,二、突变体选择,（2）间接选择法（负选法） 适用于目标表现型不具

17、有选择上的优势，即细胞未产生某种抗性物质，而是产生了一种代谢形式或表现形式的性状。,二、突变体选择,如：在抗氯酸盐细胞的选择中，分离出了硝酸还原美确实突变的细胞系。 硝酸还原酶可还原硝酸成亚硝酸，加入氯酸盐，硝酸还原酶也可还原氯酸盐成亚氯酸盐。 亚氯酸盐的毒性比氯酸盐高几百倍。 如果细胞含有硝酸还原酶，在培养基中加入20-80mmol/L氯酸盐，此浓度氯酸盐虽不足以杀活细胞，但氯酸盐可被还原成亚氯酸盐，使这些细胞被杀死，存活下来的只有硝酸还原酶确实的突变细胞。,二、突变体选择,为了克服远缘杂种的不育性，常需要进行染色体数目的加倍。 若能通过染色体加倍而恢复其育性，就能使杂种在育种工作中得到充分

18、利用。采用细胞培养方法可以达到这个目的。 利用培养过程中染色体的自发加倍现象，也可使单倍体细胞加倍，获得纯合二倍体植株，在遗传育种上有重要意义。,三、诱导多倍体,第四节 人工种子,一、人工种子的概念及意义 定义：离体培养条件下的植物材料，通过繁殖获得大量的高质量的成熟胚状体，把这些胚状体外面包上有机化合物作为保护胚状体及提供营养的“种皮”，从而创造出真种子类似的结构。 包括 ：细胞胚、人工胚乳、人工种皮,第四节 人工种子,分类：（1）裸露或休眠繁殖体 （2）种皮包裹的繁殖体 （3）水凝胶包裹的胚状体、不定芽等繁殖体 （4）液胶包埋系统,优点： （1）使自然条件下不易结实或种子昂贵的材料能快速繁

19、 殖和保存 （2）繁殖速度快，以一个体积为12L的发酵罐计算，在二十几天内可产生胡萝卜体细胞胚1000万个 （3）固定杂种优势，可使F1杂种优势多代利用，使优良单株快繁成无性系而多代利用，保持杂种材料的遗传稳定性,优点： （4）由于从任何材料都能得到胚状体，为基因工程技术应用于生产提供桥梁 （5）在人工种子的制作中，加入各种营养成分或生长调节剂，调节植物生长，提高植物抗逆性 （6）常规种子繁殖每年消耗大量粮食供播种，人工种子在一定程度上可取代天然种子而节约粮食，同时人工种子体积小，贮运方便，而且可以像天然种子那 样播种育苗。,（一）胚状体的诱导（胡萝卜） 将胡萝卜天然种子表面消毒，在无菌条件下

20、发芽成无菌苗切割下胚轴或子叶接种在含2,4-D0.51.5mg/L的MS培养基上诱导胚性愈伤组织将胚性愈伤组织悬浮在培养基中，诱导产生体细胞胚每710d更换一次培养液，震荡培养扩大繁殖量或继代培养。,二、人工种子的制备技术,（二）成熟与干燥 ：繁殖体必须同步增殖并达到成熟方可用于人工种子的制备。体细胞诱导成功后，必须转入成熟培养基。 成熟培养基特点： 在培养基中减少或除去激素 加入ABA 加入PEG,二、人工种子的制备技术,（二）成熟与干燥 ：对繁殖体进行干燥的研究发现，经过干燥的繁殖体，其人工种子的成株率可明显提高，但在另一些植物中有降低的趋势。,二、人工种子的制备技术,（三）人工种子的包裹

21、 方法 1. 离子交换法 2. 干燥法 用2.5%的聚氯乙烯作为包裹介质，然后使其干燥固化 3. 冷却法 用0.25%的胶包埋，冷却固化,二、人工种子的制备技术,因农业生产的季节性限制，要求人工种子能贮藏一定的时间，以适应生产的要求。但人工种子含水量大，常温下易失水变干，因此人工种子的保存是目前研究的一个难题。 通过对人工种子进行脱落酸、蔗糖、低温及干燥处理，可延长贮藏时间。 人工种子萌发的幼苗中弱苗和畸形苗较多，其主要原因是人工种子的质量问题，包括体细胞胚的发育和完熟程度、遗传 变异的影响等。在培养基中加入脱落酸，可明显提高胚状体的质量，增加成株率。,三、人工种子的贮藏与萌发,思考：1、说明看护培养、平板培养的特点2、什么是条件培养基？平板培养植板率怎样计算3、解释：细胞悬浮培养、成批培养、连续培养、化学恒定法、浊度恒定法4、说明细胞株筛选的方法,