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1、,第二讲 培养基,目的要求：,一、掌握培养基的种类及其特点 三、掌握培养基的组成和其适宜剂量 二、掌握MS培养基配制 四、理解培养基筛选方法,第一节 培养基的种类和成分 一、培养基种类 二、培养基成分 第二节 培养基制备 一、母液配制和保存 二、培养基配制、分装和灭菌 第三节 培养基的选择 一、单因子试验 二、多因子试验 三、逐步增减法 四、广谱实验法,一、培养基的种类 1、根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。 固体培养基是指加凝固剂的培养基。 培养基中加入一定量的凝固剂，加热溶解后，分别装入常用的培养容器中冷却后即得到固体培养基。 液体培养基是指不加凝固剂的培养基。,培养基种类,固体培
2、养基,液体培养基,营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性差。,通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长发育不整齐。,二者比较,2、根据培养物的培养过程 培养基分为： 初代培养基和继代培养基 外植体：从植物体上取出的用于无菌培养的植物材料。 植物材料：茎尖、茎段、花瓣、叶子、花药等,初代培养 ：指用来第一次接种从植物体上分离下来的外植体过程 。 继代培养：对培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养，就称为继代培养。,3、根据其作用不同，培养基分为： 诱导培养基 增殖培养基 生根培养基 4、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。 基本
3、培养基（就是通常称呼的培养基）主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。 完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。,常用培养基种类,有机成分复杂，它包括了所有的单糖和维生素 用于原生质体培养( 包括原生质融合的培养),KM-8P培养基特点：,N6培养基特点：,1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计 成分简单 KNO3 和 (NH4)2SO4含量高 广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花药培养等,White培养基特点：,1943年由hite为培养番茄根尖而设计的。19
4、63年又作了改良，称作hite改良培养基 。 特点：无机盐含量较低 适用：生根培养。,B5培养基特点：,含较低的铵 双子叶植物 尤其木本植物组培可选择,MS培养基特点： 无机盐、离子浓度高，硝酸盐含量较高。,MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培生长所需的矿物质营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡,一、无 机 盐 ,氮 枝叶生长需要氮素，缺氮老叶先发黄；氮过量，枝叶过度茂盛 。 磷 缺磷，植株生长缓慢，老叶暗紫色。 钾 促进花卉生长健壮，增强抗性，茎秆挺拔。缺钾，叶尖、叶缘枯焦，叶片呈皱曲状，老叶
5、发黄或火烧状。 钴 缺钴，叶片失绿而卷曲，整个叶片向上弯曲凋枯。,二、有 机 物,维生素,肌醇,氨基酸,天然复合物,椰子汁（CM）,酵母浸出液（YE),水解酪蛋白（CH),碳水化合物,马铃薯汁液,其它,碳水化合物,选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等 蔗糖浓度：2%3%，胚培养为4%15% 大生产时可用白糖,糖在培养基的作用： 1）为细胞提供合成新物质的碳骨架 2）为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3）维持渗透压,种类： VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、 VB3（烟酸）、Vc（抗坏血酸 浓度：0.11.0mg/L 作用：VB1 促愈伤组织产生，提高活力 VB6 促根生长 Vc 防组织褐
6、变 VB3 与植物代谢和胚的发育有关系,维生素,氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不同，其种类和浓度不同。 肌醇：又称环己六醇，在糖类的转化中起作用,常见糖和维生素及其主要性质,椰乳：促愈伤组织和细胞培养，用量1020%，使用注意茎尖大小 香蕉泥：用量150 200ml/L ，应用在兰花组培 马铃薯汁液：用量150200g/L，使苗壮 水解酪蛋白：浓度100200mg/L，应用在微茎尖培养,天然复合物,自然界中，植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、生长、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成
7、熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许多生理生化活动。 在培养基中，其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是激素。激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成、不定根、不定芽的分化，胚状体的形成等。 通常，不同植物，或不同品种，甚至同一植物的不同位置对激素的要求有很大的变化，这主要取决于植物的内源激素水平。 组织培养中使用的激素有的是天然的，如脱落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4D）,三、激素,（一）、激素的种类： 1、生长素类： 在自然界中，生长素影响茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象 在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织）
8、,组织培养中常用的生长素： 1 二氯苯氧乙酸（2，4D） 2 萘乙酸（NAA） 3 吲哚乙酸（IAA） 4 吲哚3丁酸（IBA） NAA、IAA、IBA被广泛用于生根，2，4D有利于愈伤组织的诱导和生长。 IAA容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时间不要太久。 溶解方法：1M NaOH或95酒精，以前者为好 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存,2、细胞分裂素 自然界中，细胞分裂素影响细胞分裂，顶端优势的变化和茎的分化等 组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。 常用的细胞分裂素有：
9、 6苄氨基嘌呤（6BA） 激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT） 玉米素（ZT） 噻二唑苯基脲（ thidiazuron、 TDZ ） 溶解方法：1MHCL 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存,3、赤霉素 由日本人黑泽1926年发现。自然界中，赤霉素能够打破休眠、促进果实成长等效果。虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。虽然也有赤霉素能刺激不定胚发育成正常小植株的报道，但在使用中仍需慎重，不可轻易添加。 赤霉素有20多种，其中在组织培养中最常用的是GA3。在组织培养中与生长素和细胞分裂素相比，赤霉素不太常用，据报道赤霉素能刺激不定胚正常发育成
10、小植株 溶解方法：95酒精 保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存 赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解 灭菌：高温易分解，要过滤灭菌,4、脱落酸 在自然界中，脱落酸能阻碍发育、促进老化、形成休眠芽等作用。 经试验表明，脱落酸有利于胚性愈伤组织形成正常不定芽。 材料的试管保存，加上脱落酸能抑制生长，使继代培养时间延长。 溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。 保存：具有热稳定性，但容易发生光解。 配成一定浓度后，冰箱冷藏保存,（二）、常见培养基中植物激素配方类型,（三）、常见生长调节剂及主要性能一览表,（四）、常见生长调节剂的微摩尔/升浓度与毫克/升的换,四、培养体支持材料,1.琼脂 用
11、量710g/L（0.7%-1%） 注意：1 若浓度过高，培养基就会变得很硬，营养物质就难于扩散到培养的组织中。 2 当进行营养需要研究时，应注意不要使用琼脂，因为市场供应所有琼脂含有杂质，特别是含有Ca,Mg和微量元素。 2.其它 卡拉胶、玻璃纤维、滤纸桥、海绵等,五、辅助性物质,1.抗生素 2.抗氧化物 3.活性炭,抗生素,1.常用种类：青霉素链霉素 庆大霉素等 2.用量：5%20% 3.作用：防止由外植体内生菌造成的污染。 4 过滤灭菌,抗氧化物,常用抗氧化剂及使用： 半胱氨酸VC（50200mg/L液洗涤外植体伤口表面）。,活性炭,1.作用：具吸附作用；茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖
12、（浓度0.1 0.2%）；促进生根；防止组培苗玻璃化（浓度0.3%）。利于胚胎培养。2.常用浓度：0.510g/L 3.活性炭的作用 对生长的抑制：其吸附了植物激素 对生长的刺激：其吸附了有抑制作用的物质,第二节 培养基配制,一、母液配制与保存,二、培养基配制,(一)母液配制流程图,称 量,母液分装,确定培养基,溶 解,定 容,贴标签,保存于冰箱,一、母液配制 (以MS为例),称量药品,天平预置 全显示 清 零 称 药,(二)母液配制要求： 1.母液浓缩倍数：10-100 ，大量元素10；微量元素、铁盐100；有机物50； 2.选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂 3.防止沉淀 4.激素母
13、液浓度：1mg/ml,1次配成50或100 ml 5.激素溶解： IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容； NAA先溶于热水或95%酒精再加水； 2，4-D先溶于1M NaOH再加水； KT、BA先溶于1M HCl再加水。,为什么要配制母液？ 1）方便 2）准确（有些成分量太小） 3）母液要分类配， 否则有些成分混合一起会产生沉淀 以MS培养基为例：,MS培养基母液的配制,母液保存：,在冰箱内低温保存,二、培养基配制,移母液,调PH值,培养基熬制,灭菌,称取蔗糖、琼脂,扎口,定容,分装,二次定容,接种,确定配方,大量元素母液,微量元素母液,铁 盐母液,有机物母液,取100ml,取10m
14、l,取10ml,取10ml,注：MS培养基配制,容量瓶,要求：一次性移取，不能吸进吸气球里，数量看准，不滴不漏，吹净为度。,移母液,用自来水定容至1升,定 容：,称取蔗糖、琼脂,用自来水定容到1升 取蔗糖2530g，琼脂78g。,培养基熬制：,3.将容量瓶中剩余的液体一并倒入铝锅中，摇晃使均匀。,1.将定容好的培养液取1/3倒入铝锅中，同时加入称好的蔗糖和琼脂，边煮边搅拌，防止糊底。,2.用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。,用0.1MNaOH或HCl调PH值为6.0。,调PH值：,分装：,趁热分装，100ml的三角瓶约装入3040ml 。,扎口与灭菌:,要求封口松紧适宜，系活扣，便于
15、接种操作。,培养基应及时灭菌，防止变质。,灭菌后，应尽快地转移培养瓶使其冷却，一般应将灭菌后的培养基储藏于30以下的室内名，最好储藏在410的条件下。 应当注意的是，某些生长调节物质如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素是不稳定的，不能和其他的培养基一起高压灭菌，而要进行过滤灭菌。,第三节培养基的选择,一、单因子试验 二、多因子试验 三、逐步增减法 四、广谱试验法,2种激素5种浓度的实验组合,6BA（mg/L),A1 A2 A3 A4 A5,NAA（mg/L),B1,B2,B4,B3,B5,B1A1 B1A2 B1A3 B1A4 B1A5,B2A1 B2A2 B2A3 B2A4 B2A5,B3
16、A1 B3A2 B3A3 B3A4 B3A5,B4A1 B4A2 B4A3 B4A4 B4A5,B5A1 B5A2 B5A3 B5A4 B5A5,2种激素3种浓度的实验组合,NAA（mg/L),6BA（mg/L) 低中高,低,中,高,低低 低中 低高,中低 中中 中高,高低 高中 高高,广谱试验法,1 把培养基分为4个大类：无机盐、生长素、细胞分裂素和有机营养物质。 2 对每一类物质再选定3个浓度，既：低（L)、中（M）和高（H）、4类物质各3种浓度的各种不同组合构成了一项包括81个处理的试验。 3 在这81个处理中最好的一个用4个字母表示，例如：一个包含中等浓度无机盐、低浓度生长素、中等浓度
17、细胞分类素和高浓度有机营养物质的处理表示为：MLMH。 4 达到这个阶段后，可以再试验不同类型的生长素和细胞分裂素，以找到它们的最好类型。因为有些试验系统对生长素和细胞分类素这两类生长物质的具体形式比较敏感。,NAA,A：NAA 0mg/L，芽（少），根（无） B：NAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量） C：NAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量）,A B C,BA,A：BA(0mg/L) ，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量） B：BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）,A B,复习思考题：,初代培养，继代培养 初代培养基，继代培养基 MS培养基：琼脂和蔗糖的加入量一般为多少？ 培养基的成分包括哪几类？ 在组织培养中，生长素和细胞分裂素的作用是什么？,？ ？,复习思考题：,1.培养基的种类及特点有哪些？ 2.培养基的成分、作用及常用的剂量。 3.如何配制MS培养基？,？,