细胞工程原理.ppt

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1、第一章 细胞工程原理,第一节 细胞全能性（Totipotency ）,一、细胞全能性概念的发展,1902年，德国植物学家Haberlandt 发表了著名论文植物细胞离体培养实验，提出了细胞全能性的观点。他认为，作为高等植物的器官和组织基本单位的细胞有可能在离体培养条件下实现分裂分化。并且预言：在未来，人们可以成功地从体细胞培养出人工胚。由于当时的知识和技术水平的局限，他们的实验未能成功，但是却开辟了植物学研究的新领域植物组织和细胞培养。,Haberlandt,1934年，White首次给细胞全能性下定义：每个植物活细胞在合适的培养条件下，都有发育成为胚的能力。 1958年，Steward等 和

2、Reinert等从胡萝卜细胞培养物中获得了人工胚，进一步形成了完整的植株。 Guha等(1964； 1966)先后获得了曼陀罗的花粉胚和单倍体植株。 Srivastava等（1973）和Sethi等（1976）分别从寄生植物罗氏核实木胚乳和黑种草胚乳三倍体组织获得了胚状体。 此后，又有众多植物种类的离体培养获得了胚状体。 1960年，Sinnoit等认为：全能性意味着每一个细胞中包含着一个完整有机体的全部基因，在适合的条件下，一个细胞就会形成一个完全新的有机体。 1984年，国际组织培养协会：细胞全能性是细胞的某种特性，有这种能力的细胞保留了形成有机体所有细胞类型的能力。,细胞全能性：每个植物

3、活细胞具有该物种的生命特征属性，在合适离体培养条件下，可以展现这些特征属性。,注意点：虽然植物细胞都具有全能性，但由于诸多原因（如基因型、分化程度、生理状态等的差异），其再生能力、脱分化能力及再分化能力可能都大不相同，培养难度差别很大甚至无法培养，应采用多种办法克服解决。,生命延续的方法,生命存在的基础,二、植物活细胞具有生命特征属性 1、生命的基本特征属性,新陈代谢 (metabolism) 应激性 (irritability) 自体复制 (autoduplication),新陈代谢是维持生命各种活动（如生长、繁殖和运动等）过程中的化学变化的总称（或：生物体内全部有序化学变化的总称。它包括物

4、质代谢和能量代谢两个方面）。生物体总是不断地从环境中摄取物质和能量，用以建造和维持自身。与此同时，又有同等数量的能量，以热和其他形式排出体外，并在环境中迅速散布开来，增加环境的紊乱状态，也就是通常所说的使环境的“熵”值增加。一旦新陈代谢停止，生命活动也就停止，生物体就会瓦解。,1） 新陈代谢,应激性也是非常重要的生命特征属性，因为生命的存在离 不开环境条件，而环境条件又是在不断变化的，其中既有日夜 交替、四季更迭的规律性变化，也有险敌突临、气候骤变等突 发的非规律性变 应激性就是生物体随环境变化的刺激而发生相应反应的特性。 生物体具有“某种机制”来感知和正确估计环境的变化，以便在其体内进行校正

5、，保持体内平衡或对环境表现出有利于自身生存的反应。应激性的表现因物种的不同而多种多样，例如，大肠杆菌在以乳糖作唯一碳源时的生存反应；动物对险敌的逃避反应；植物的某些反应，如通过休眠度过不利环境；在受到损伤时，部分器官可以脱落掉并再生成新的个体，保持生命的延续。,2） 应激性,自体复制是指生物体利用自身作为模板，通过代谢作用，复制出完全相同的结构，或产生具有相同的自体繁殖能力的突变结构。前者，人们称之为“遗传”，后者，则称之为“变异”。自体复制是“生命的最鲜明的特征”，可以看作生命状态的精华。藉此特征属性，生物种群才能繁衍续存不致灭绝。 不同生物类群的自体复制方式不尽相同。单细胞生物通过简单的细

6、胞分裂，即可实现自体复制。而高等生物必须经历一个个体发育过程。即从受精卵开始，经细胞分裂分化、组织分化、器官形成、直至性成熟，产生配子，然后精、卵配子结合，形成合子，才能实现自体复制。,3） 自体复制,2、植物细胞具有生命的基本特征属性 生物体由无生命的分子组成，组成生命的各种分子都服从非 生命物质的有关定律。那么，生命的特征属性从何而来？ 近代细胞生物学研究表明，生命的特征属性来自细胞。虽然 构成细胞的最重要的遗传物质核酸，是可以自体复制的物 质，但当它单独存在时，并不表现生命的特征属性。只有和蛋白 质结合时，才具有生命的特征。最典型的例子是，病毒核酸只有 侵入宿主后，依靠宿主的一些机制（酶

7、系统）才能繁殖，如果离 开细胞，则会失去生命的属性。由此可见，只有核酸和蛋白质与 其他分子组成一定的遗传器（细胞），才能表现完整的生命活动。,那么，在一个多细胞植物体中，是不是每一个细胞都具有这 些特征属性？这些特征属性都可以表现出来吗? 事实上，虽然每一个细胞都从合子得到同样的基因储备，但 这些基因并没有全部开放。在某一特定的时间内，只有5-10%的 基因发挥作用，也就是说，只有一小部分的基因被转录和翻译， 形成特异蛋白质，并导致细胞结构和功能的特化。这样，不同的 基因在不同的时空中起作用，导致结构和功能特化的细胞以一定 的方式装配成一个完整的个体。每个细胞被固定在特定的时空 中，受到所处组

8、织的制约，只表现出一小部分的生命特征属性。,3、离体培养条件下的细胞具备相应的生命特征属性 培养细胞的新陈代谢事实证明，细胞只要在培养条件下存活，就具有新陈代谢特性。例如，在合适的条件下，绿色细胞具有光自养能力，固氮植物的细胞具有固氮特性，而药用植物细胞也会具有药物合成的能力，等等。,培养细胞的应激性当细胞被切离下来，培养于人工条件下，就会表现出应激性：非绿色细胞脱离了自养的母体之后，应变出对人工的营养配方和环境条件的适应性，以异养方式生存发展；脱离母体时的切割损伤以及应激于培养条件而出现脱分化，并在合适的条件下进行再分化，都是植物应激性的典型表现。所以，培养细胞具备应激性。,培养细胞的自体复

9、制 培养细胞的分裂能力在每一个成功的离体培养实验系统中均得到证实。另外，大量的研究表明，比完整细胞略小的细胞结构原生质体，也能培养而再生成新个体，甚至能够通过原生质体之间的融合，创造出新的物种（体细胞杂交）。由此可见，培养的植物细胞完全具有自体复制的特征属性。,第三节脱分化与再分化 一、几个基本的名词术语 分生（generating） 分化（differentiation） 脱分化(dedifferentiation):已经分化的细胞(即成熟细胞)，在一定条件的刺激下，丧失了原有的结构和功能，回复到无结构的分生组织状态，称为脱分化。,特征：呼吸作用加强，合成代谢变得旺盛，细胞壁由厚变薄，细胞内

10、部结构也发生变化。,再分化（redifferentiation)：由脱分化的细胞(如愈伤组织)，经 过再一次的分化，形成新的器官甚至完整植株的现象。 特征：细胞壁变厚，导管细胞形成，酶水平的变化和明显的机能分化。,再生作用（regeneration）：植物的某些器官具有形成新器官甚至新个体的作用。 形态发生（morphogenesis）：分化或再分化的结果，使培养材料从“不具有固定形态结构的状态”转变为“具有固定形态结构（形成新器官，呈现极性生长）的状态”。简而言之，“形态发生”是指生物在个体发育或再生过程中，形成器官、机体等形态结构的过程。,植物组织培养：将植物的任何器官、组织或细胞，在人工

11、预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基上，使其生长、分化形成完整植株的过程。根据培养物的来源及大小不同，可分为6个层次（或水平）：,植物培养 器官培养 胚胎培养 组织培养 细胞培养 原生质体培养,易,难,二、脱分化 植物体是一个具有高度结构的多细胞系统。其中的不同细胞或 组织都是高度分化的，它们互相协调而发挥作用，这些分化的体细 胞经过分裂后只产生相应的组织或器官，其细胞的全能性不能表达。 为了使这样的细胞重新获得分化能力，就需要对其进行一些刺 激，帮助其回复到未分化的原始状态（即分生组织状态），这一过 程称之为脱分化。脱分化的实质是解除分化，是成熟体细胞返老还 童

12、的一种表现。 脱分化后，成熟体细胞回到分化前的状态，重新具有表达全能 性的能力。,大量的研究表明，具有一定结构的植物组织或器官，与母体组 织分离后并在一定的条件下培养之后，其细胞就可以脱分化并形成 愈伤组织，这种愈伤组织往往能够很好地进行增殖。 几乎所有的植物都有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。或者 说，诱导愈伤组织成败的关键主要不是实验材料，而是培养条件， 尤其是激素的种类和浓度（生长素和细胞分裂素）。 脱分化的起始涉及到特定基因的表达，在外源生长素的诱导 下，某些基因被激活，RNA合成增加，酶活性提高，为DNA的复 制作好物质准备。然后，外植体切口边缘开始膨大，外层细胞开始 分裂，这些细胞的

13、核大，核仁明显，出现大量分生细胞团，细胞代 谢十分活跃，细胞中RNA、蛋白质和DNA的合成量相继达到峰 值，细胞分裂迅速并形成肉眼可的愈伤组织，标志着脱化的实现。,需要补充说明的是，细胞脱分化的结果，在多数情况 下是形成愈伤组织，但也有不少实验证明，一些外植体的 细胞脱分化后直接分化为胚性细胞，进而形成胚状体，其 间并没有愈伤组织的形成。因此，也不能将脱分化和愈伤 组织二者等同起来。,高等植物细胞脱分化和再分化示意图,器官分化,完整植株,细胞再分化,细胞分裂,细胞脱分化,Dedifferentiation,Redifferentiation,成熟细胞,分生细胞,多细胞团 (愈伤组织),胚胎发生

14、,细胞的脱分化能力与其分化程度呈负相关：,三、再分化 脱分化的细胞在形态发生上具有较大的可塑性，在适当的条件 下可分化出不同种类的细胞、组织甚至完整植株： 细胞水平：薄壁细胞，分生细胞，管胞细胞，色素细胞，石细胞，纤维细胞等； 组织水平：如维管组织； 器官水平：由分化出的不同组织形成各种器官(根、茎、叶、芽等)，最常见的方式是先芽后根； 植株水平：先芽后根，先根后芽，或两者独立发生后贯通成苗。,四、体细胞胚胎发生 1、体细胞胚胎概念的特点 （1）体细胞胚是组织培养的产物，只限于组织培养范围内使用，区别于无融合生殖的胚； （2）体细胞胚起源于非合子胚，区别于合子胚； （3）体细胞胚的形成经历胚胎

15、发育过程，区别于组织培养中的器官发生（芽、根分化）。,合子胚与体细胞胚异同点： 不同点：合子胚由合子发育而成，遗传物质来自于两个亲本细胞，是有性生殖的结果；体细胞胚的遗传物质仅由一个体细胞提供，是无性生殖过程形成的。 相同点：都含有一整套遗传信息，都可以发育成新一代生物个体。,合子胚的形成过程,2、体细胞胚的特点 （1）具有两极性（结构完整）； （2）存在生理隔离（与外植体维管组织少有联系）； （3）遗传相对稳定； （4）繁殖速度快，数量大。,3、体细胞胚胎发生的普遍性 据不完全统计，全世界约有1000多种高等植物进行 过离体培养研究，其中绝大多数能够通过体细胞胚胎途径 形成再生植株。由此可见

16、，体细胞胚胎发生途径已成为植 物离体培养中的一个基本的途径（普遍性）。 相对于被子植物而言，裸子植物（如松柏类）体细胞 胚胎发生的难度较高；另外，单倍体细胞（如小孢子）胚 胎发生的难度高于二倍体细胞，但也有不少的成功之例。,4、体细胞胚胎的发生途径（2种） （1）直接途径 体细胞胚直接发生于外植体的某些部位，如下胚轴 的表皮、子叶表面等。 （2）间接途径 外植体脱分化形成愈伤组织，然后在愈伤组织上分化 出体细胞胚。 两种途径中，后者是主要的途径。其通常的过程是， 愈伤组织中某些体细胞转化为胚性细胞，胚性细胞持续分 裂形成多细胞原胚，原胚继续发育成为成熟的体细胞胚。,五、离体培养条件下细胞的脱分

17、化和再分化的时期,从植物体上切下来的一块组织，经过离体培养到器官发生，大致可分为诱导期（细胞分裂的准备期）、分裂期（细胞从开始分裂到持续分裂的时期）和分化期（从愈伤组织形成到器官发生）三个时期。,诱导期：细胞分裂的准备期,一切组织从完整植物体上分离下来的当时，构成组织的细胞一 般都处于静止状态，称为静止细胞。 诱导期细胞的特征：细胞质增加，出现活跃的原生质流动，贮 藏物质淀粉等消失；随着组织的活化，细胞内核糖体增加并形成大 量多聚核糖体；RNA迅速合成和累积。Steward等(1964)胡萝卜试 验说明，与细胞数目增加前比，RNA的含量增加了8倍，但细胞的形态和大小没有变化。,分裂期：细胞从开

18、始分裂到持续分裂的时期,细胞开始分裂,分裂期划分,愈伤组织生长,愈伤组织,细胞团,细胞的特点： 细胞数目增加、体积变小、 核和核仁变大、RNA含量持 续上升。培养物的外层细 胞迅速分裂。当细胞体积最 小，细胞核和核仁最大， RNA含量最高时，标志着细 胞处于分裂高峰时期。,分化期：从愈伤组织形成到器官发生,组织分化,器官分化,细胞分化,植株形成,在适合的条件下，离体培养物可以分化出各种各样的组织。 其中，拟分生组织和维管组织为两种重要的组织。因为一旦培养物中分化出这两种组织，并且它们之间能发生一定的联系，就可能导致器官原基的形成，从而进一步分化成器官。 在此期间， 细胞形态大小保持相对稳定，体

19、积不再减小，愈伤组织不再增殖。细胞由原来分裂期的平周分裂转变为组织内部局部区域的分裂，形成“瘤状结构”和“片状结构”，这些结构都是由分生组织构成。,再生植株的形成途径,1、器官发生 概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形 成根和芽等器官的过程。 发生方式：有两种发生方式 （1）直接发生：由（具有初生分生能力的）外植体直接分化成器官的方式（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生） 。 （2）间接发生：由外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织后再分化形成器官的方式。,器官发生途径,胚胎发生途径,再生植株,再生植株的形成途径,2、胚胎发生(embryogenesis)

20、 概念：由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，亦称胚状体。 发生来源方式：四种 （1）由外植体直接形成：下胚轴、子叶、茎表皮等外植体脱分化后可直接产生胚。 （2）由愈伤组织形成：愈伤形成胚胎发生丛（EC），可形成大量的胚状体 （3）由悬浮细胞形成； （4）由单倍体细胞形成。,完整植株的形成,外植体,脱分化,体细胞胚,愈伤组织,再分化,再分化,完整植株,器官发生（芽、根）,第四节 培养细胞的遗传变异,一、培养细胞变异增多现象及其价值 通常将组培中的变异分为两类，即人工变异和自然变异。 人工变异是人为诱发的变异，一般具有一定的方向性，主要用于选育种的研究 (如秋水仙素、各种射线、太空辐

21、射) ； 自然变异大多数没有方向性，以劣变为主，会给生产带来巨大的损失，应尽可能减少。 对于育种研究而言，应提高变异率以获得较多的变异材料，对于组培快繁而言，则必须使变异率降至尽可能低（5以内）。 如果培养条件（包括培养基组成）不当，变异率可能会很高，例如40-60甚至100，远远高于田间栽培的变异率。,香蕉的组培快繁中，各个阶段都可能出现变异或异常的情况： 芽的表现：叶鞘肥大、变褐；芽细矮，叶鞘散开；叶鞘披散，新叶 细；芽白化，叶鞘散开；芽基部呈球状，颜色变褐；芽细长，叶 鞘散开；芽细白色，基部褐变；芽扁平，叶鞘散开。 芽苗的表现：矮化苗；白芽苗；豆芽苗；多分蘖苗；扭曲苗；披散 苗；畸形苗；

22、叶片重叠苗；高节位生根苗。 袋苗的表现：缺绿株；特矮株；特高株；扭曲株。 其中，对产量影响最大的为：叶片扭曲株，叶片披散株，特矮株，高节位生根株，特高株和缺绿株。,二、影响变异的因素 1、基因型 物种，品种，嵌合体与否（如花叶姜），单倍体或二倍体。(马铃薯和菠萝可高达100；棉花30-90) 2、继代次数 香蕉：培养5代的变异率为2.14，10代为4.2，20代达100（故不可超过1年） 。 蝴蝶兰：继代培养4年后，没有1株能够开花（丧失了成花能力），故每2年更换一次。 3、外植体类型：胚(胚器官等) 、茎段、茎尖其遗传最为稳定，不易发生变异，而高度分化的组织，如果实、叶片等，在培养过程中易发

23、生变异(菠萝幼果愈伤组织变异率100，冠芽愈伤组织7)。 4、培养基与培养条件 影响很大，主要涉及：激素、蔗糖浓度、温度及温度的变幅等。,利用价值： 变异在种质资源保存上是不利的因素，但另一方面也有育种利用价值。如菊花的变异、香蕉的矮化等。,第四节 培养细胞的遗传变异,三、变异的遗传基础染色体数目、结构变异及基因突变 、染色体未断裂，染色体数增加（多倍体）； 、染色体未断裂，染色体数减少； 、染色体断裂并引起染色体数增加； 、染色体断裂但不引起染色体数目变化； 、体细胞核内再复制； 、基因突变； 、转座子的作用。,（该部分自学，p36-37）,四、克服变异的措施 1、严格控制继代次数 2、尽量使用温和的培养基及培养条件 3、选用适当的增殖方式（尽可能利用现成的生长点进行增殖和分化） 4、在离体培养的各阶段不断地检查和剔除变异材料,概念：利用物理因素（如x射线、 射线、紫外线、激光等）或化学因素（如亚硝酸、硫酸二乙酯等）处理生物，使生物发生基因突变。 原理： 利用辐射使植物染色体畸变,基因发生突变,从而产生新的形状.,诱变育种,优点：提高变异的频率，加速育种进程，大幅度地改良某些性状等。 缺点：难以控制突变方向，无法将多个优良性状组合。 应用：农作物育种黑农五号大豆 (产量提高16%、含油量提高2.5%) 微生物育种青霉素 (20单位/ml50000单位/ml),拓展视野：,