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1、细胞的破碎与分离,概述,很多生化产物存在于细胞内(胞内产物) 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型成分的基础。,胞内物,分离,概述,细菌细胞壁结构,back,酵母细胞壁结构,一、细胞壁的组成和结构,细胞破碎机理图,细胞破碎,细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度； 由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。,细胞破碎,细胞破碎,1.珠磨法（Bead mill）,细胞破碎,高压匀浆器,细胞破碎,细胞破
2、碎,超声破碎法（Ultrasonication,在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。 空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。,20Hz,20000Hz,正常人耳能听到的声音的频率范围,超 声,次 声,细胞破碎,撞击破碎,化学破碎方法,酸碱法 表面活性剂 有机溶剂,化学破碎方法,通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。,化学渗透法优点：,缺
3、点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,物理破碎方法,渗透压冲击 冻融法,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。,1. 破碎率的测定,直接测定法 目的产物测定法 导电率测定法,采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。,将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。,破碎率的测定,破碎率的测定,0.05%美蓝染色结果,基因工程包涵
4、体的纯化,基因工程菌培养液不同表达形式的前处理 胞外分泌型表达：离心,收集液相浓缩纯化。 胞内表达： 胞内可溶性表达：离心,收集菌体细胞破碎离心，收集上清纯化 胞内周质表达：离心,收集菌体低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物离心,收集上清液纯化。 不溶性包涵体：离心,收集菌体细胞破碎离心,收集沉淀包涵体洗涤目标蛋白变性溶解复性纯化。,包涵体的分离和蛋白质复性,包涵体： 指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒 。 形成原因：,表达量过高、过快,外源蛋白在大肠杆菌中的积累,包涵体表达形式的优点,在一定程度上保持表达产物的结构稳定; 能避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集;
5、简化外源基因表达产物的分离操作; 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白,包涵体表达形式的缺点,以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白。 体外复性蛋白质的成功率相当低， 一般不超过 30% 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。,包涵体的纯化方法,收集菌体细胞,细胞破碎,包涵体的洗涤,目标蛋白的变性溶解,目标蛋白的复性,包涵体获得几种常见的工艺路线(一),机械破碎 (高压匀浆、高速珠磨）,离心提取包含体,加变性剂溶解,除变性剂复性,包涵体获得几种常见的工艺路线（二）,机械破碎,膜分离获得
6、包涵体,加变性剂溶解包含体,除变性剂复性,1）包涵体的洗涤 细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。,包涵体的溶解,包涵体的分离和蛋白质复性,二硫键,目 的,次级键,变性剂,去污剂,还原剂,盐酸胍、尿素,SDS、Triton 100,巯基乙醇、DTT,包涵体的复性,包涵体的分离和蛋白质复性,游离巯基 次级键,重新折叠 形成,复性,通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,复性注意事项,最适pH值范围为8.0-9.0之间； 温度适宜选择4； 复性过程蛋白浓度不宜过大，0.1-0.2mg/mL 复性时间一般为24-36小时；,