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1、细菌性疫苗与类毒素的生产工艺,细菌性疫苗,对某一特定传染病产生或增加人工免疫力的制剂,包括死亡的微生物(死毒)、活的但减弱其毒性的(弱毒)以及活的毒性充分的(强毒)三种 。一般分为活菌苗及死菌苗两类。,分类,活菌苗：常用者有预防结核病的卡介（BCG）、鼠疫活菌苗等。制备活菌苗的关键在于获得减毒或无毒菌株，但该菌株应保持免疫原性。活菌苗接种后，在体内有一定的生长繁殖能力，类似经型或隐性感染。一般只需接种一次，且需量较小，但引起的免疫效果好，且能维持较长时间。,死菌苗：用化学或物理方法将病原菌杀死后仍保持免疫原性可制备死菌苗。常用的死菌苗有霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙混合菌苗、百日咳菌苗等。死菌苗大多
2、需要多次接种才能获得较好的免疫效果。为减少死菌苗的接种次数，现常将不同种类的死菌苗作合理混合，制成联合菌苗，如伤寒菌、甲、乙型副伤寒菌混合的三联菌苗。,类毒素,又称减力毒素，变性毒素。一些经变性或经化学修饰而失去原有毒性而仍保留其免疫原性的毒素。医学微生物学中将类毒素定义为：将细菌外毒素用0.3%0.4%甲醛处理脱去其毒性，保存其免疫原性即为类毒素,菌种的选择,菌种必须具有特定的抗原性，能使机体诱发特定的免疫反应；菌种应具有典型的形态、培养特性和生化特性，并在传代的过程中，能长期保持这些特性；菌种应易于在人工培养基上培养；制备灭活菌苗，菌种在培养过程中应产生较小的毒性；制备活菌苗，菌种在培养过
3、程中应无恢复原毒性的现象；制备毒素，菌种在培养过程中应能产生大量的典型毒素。 制备菌苗和类毒素的菌种，应该是生物学特性稳定，能获得安全性好、效力高的生物制品的菌种。,培养基的营养要求,除碳源、氮源和各种无机盐类等培养微生物所需要的一般营养要素外，由于某些微生物生理上的特殊性，往往需要某些特殊营养物才能生长。例如结核杆菌需以甘油作为碳源；有些分解糖类能力较差的梭状芽孢杆菌需以氨基酸作为能量及碳与氮的来源。培养致病菌时，在培养基中除应含有一般碳源、氮源和无机盐成分外，往往还需添加某种生长因子。,菌种制备,菌种使用前应进行培养特性、血清学特性、毒力试验、毒性试验、抗原性试验、免疫力性试验的检定。 一
4、代种子：冻干菌种接种于适宜的培养基上，于371培养一定的时间。 二代种子：一代种子接种于适宜的培养基上，于371进行扩大培养。 菌种开启后用于生产时不能超过规定的传代数。,培养,根据不同的菌种和要求选择适合的培养基，常用的培养方法有固体培养法和液体深层培养法。大规模生产多采用液体深层通气培养法。细菌培养时应注意下述4种因素的控制。 气体 各种细菌在生长时对痒的要求不同。在培养特定的细菌时，必须严格控制培养基环境的氧分压。 温度 致病菌的最适培养温度大都接近人体的正常温度（3537）。在制备菌苗时，必须先找出菌种的最适培养温度，在生产工艺中加以严格控制，以获得最大的产量和保持细菌的生物学特性和抗
5、原性。,PH值 同一细菌能在不同的PH值下生长。培养的PH值不同，细菌的代谢产物有可能不同。因此，在培养细菌时，应严格控制培养基的PH值，以使它们按预定的要求生长、繁殖和产生代谢产物。 光线 制备生物制品的细菌，一般都不是光合细菌，不需要光线的照射。故培养不应在阳光或X射线下进行，以防止核糖核酸分子的变异，从而改变细菌的生物学特性。,收菌,固体培养法培养的细菌，在采集时应逐瓶检验，污染杂菌的废弃，未污染的将军苔刮入含PBS的大瓶中。液体培养时，将培养液直接收集到大瓶或其他容器中，逐瓶进行无菌试验，污染杂菌的废弃。 PBS:全称Phosphate Buffered Saline.在医学词汇中表示
6、磷酸盐缓冲液，用于分子克隆及细胞培养，pH=7.4,与人体血液等渗，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠及氯化钾。,杀菌,灭活疫苗制剂在制成原液后需要用物理或化学方法杀菌，各种菌苗所用的杀菌方法不相同，但杀菌的总目标是彻底杀死细菌而又不影响菌苗的防病效力。以伤寒菌苗为例，可用加热杀菌、甲醛溶液杀菌、丙酮杀菌等方法杀死伤寒杆菌。我国多采用甲醛作为杀菌剂，甲醛的终浓度不超过1 （体积分数，ml/ml），置37一定时间或28一定时间杀菌。 杀菌后的原液还要进行无菌检查，方法是：取样接种于不含琼脂的硫乙醇酸盐培、养基琼脂斜面及碱性置各1支，置37培养5天，应无本菌生长。,原液检定与保存,1、浓度测
7、定 应按中国细菌浊度标准测定浓度 2、镜检 涂片染色镜检，至少观察10个视野，应该菌形典型且无杂菌。 3、凝集试验 用相应血清做定性凝集试验，呈阳性反应。 4、无菌试验 需氧菌、厌氧菌及真菌试验呈阳性。 5、免疫力试验 以一定菌数的剂量免疫小鼠，再用致病菌攻击小鼠，观察并记录小鼠死亡数，计算ED50或LD50结果，达到要求即合格。 6、原液保存 28保存。 自采集之日起有效期一般为34年,稀释、分装和冻干,经杀菌的溶液，一般用含防腐剂的缓冲生理盐水稀释至所需浓度，然后在无菌条件下分装于适当的容器，封口后在210保存，直至使用。有些菌苗，特别是活菌苗，亦可于分装后冷冻干燥，以延长它们的有效期。,ED50（半数有效量）：指在量反应中能引起百分之五十最大反应强度的药物剂量；在质反应中是指引起百分之五十实验动物出现阳性反应的药物剂量。 半数有效量常以效应指标命名，如效应指标为死亡，则成为半数致死量（LD50）,Ending.,