氨基酸的测定方法.pdf

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1、氨基酸的测定方法氨基酸的测定方法茚三酮柱后衍生法茚三酮柱后衍生法 北京市营养源研究所 叶颖慧 参考方法：GB/T 5009.124-2003 食品中氨基酸的测定 从各种生物体中发现的氨基酸有 180 多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸有二十二 种。除脯氨酸外，这些氨基酸在结构上的共同点是与羧基相连的 -碳原子上都有一个氨基，因而称 -氨基 酸。结构通式如下： 1.适用范围适用范围 本方法适用于食品中蛋白质水解得到的天冬氨酸、苏氨酸等十六种氨基酸的测定；不适用于蛋白质含 量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食品中氨基酸测定。 2.原理原理 食物中的蛋白质经盐酸水解，成为游离氨基酸，再用氨

2、基酸自动分析仪进行测定。 氨基酸分析仪是应用离子交换层析原理，离子交换柱树脂为磺酸型强阳性阳离子交换树脂。氨基酸与 树脂中的交换基团进行离子交换，用不同 PH 的缓冲溶液进行洗脱时，因交换能力的不同而将氨基酸混合 物分开，一般是酸性和含羟基的氨基酸最先被洗脱下来，然后是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。分离流 出色谱柱的氨基酸在 135下与茚三酮反应生成紫色物质茚二酮炔一茚二酮胺（DYDA），通过分光光度 计测定其含量。其最低检出限为 3 pmol。 （1）蛋白质水解原理）蛋白质水解原理 蛋白质是由氨基酸通过肽键首尾相连而成的共价多肽链。一分子氨基酸中的羧基与另一分子氨基酸分 子的氨基脱水而形成的

3、酰胺叫做肽，其形成的酰胺键称为肽键。 蛋白质水解就是使蛋白质逐渐降成分子量越来越小的肽段， 破坏肽键， 直到最后成为氨基酸的混合物。 （2）氨基酸分离原理）氨基酸分离原理 氨基酸是两性电解质，在水中既起酸（质子供体）的作用，也起碱（质子受体）的作用。 氨基酸在溶液中的存在形式： NH2CH R C O OH NH2CH R COOH + - H2O NH2CH R C O NHCH R COOH 肽键 氨基酸分离： （2）氨基酸与茚三酮反应原理）氨基酸与茚三酮反应原理 3.试剂试剂 除注明外全部试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。 （1）6 mol/L（0.5%巯基乙酸）盐酸溶液：优级浓盐酸与

4、水以体积1比1混合，加入巯基乙酸5 mL混匀。 （2）0.02 mol/L的盐酸溶液：吸取1 mL的6 mol/L盐酸溶液，加入300 mL的蒸馏水，混匀即可。 （3）BRIJ-35溶液：25 g溶于100 mL蒸馏水中。 （4）缓冲溶液：（参考日立L-8900氨基酸自动分析仪） 三菱化学公司生产的MCI RL-8500 系列缓冲溶液，或根据下表配制缓冲溶液 名称 PH-1 PH-2 PH-3 PH-4 PH-RG 容器 B1 B2 B3 B4 B6 钠浓度N 0.16 0.20 0.20 1.20 0.20 密度 1.02 1.02 1.02 1.06 1.00 1 蒸馏水（约） mL 70

5、0 700 700 700 700 2 柠檬酸钠（二水） g 6.19 7.74 13.31 26.67 3 氢氧化钠 g 8.00 4 氯化钠 g 5.66 7.07 3.74 54.35 5 柠檬酸（一水） g 19.80 22.00 12.80 6.10 6 乙醇 mL 130.0 20.0 4.0 100.0 7 苯甲醇 mL 5.0 8 硫代双乙醇 mL 5.0 5.0 5.0 9 BRIJ-35溶液 mL 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 10 PH（标称） 3.3 3.2 4.0 4.9 11 总计（校准） L 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 12 辛酸

6、mL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 注：上表仅供参考。根据不同的仪器和不同的色谱柱，需要调整缓冲溶液的配方。 （5）茚三酮溶液： 日本和光纯药工业公司成套茚三酮试剂，或根据下表配制茚三酮试剂 容器 步骤 试剂 计量 单位 R1茚三酮 1 乙二醇独甲醚 979 mL 2 茚三酮 39 g 3 氮气起泡，分解 5 min 4 硼氢化钠 81 mg 5 氮气起泡 30 min 密度 0.96 R2茚三酮缓冲溶液 1 蒸馏水 336 mL 2 醋酸钠 272 g 3 冰醋酸 123 mL 4 乙二醇独甲醚 401 mL 5 总计 1000 mL 6 氮气起泡 10 min 密度 0.96 R

7、35%乙醇溶液 1 蒸馏水 950 mL 2 乙醇 50 mL 3 总计 1000 mL 密度 1.00 （6）氮气 （7）标准溶液配制 购买的氨基酸原液（Fluka AAS18）中每种氨基酸的浓度为2.50 mol/mL。 氨基酸标准液中吸取 2mL，用0.02 mol/L盐酸稀释定容至50 mL。每20 L溶液中，每种氨基酸含量 为2 nmol，稀释后标准于冰箱中冷藏，保存期约1个月。 也可根据下表配制 标准名称 称样量 定容体积 标准原液 浓度 分子量 吸取体积稀释体积 定量管 上机浓度 mg mL mg/mL g/mol mL mL ul n mol/20ul ASP 33.28 25

8、0 0.13312 133.11 5 50 20 2.000 THR 29.77 250 0.11908 119.08 5 50 20 2.000 SER 26.27 250 0.10508 105.06 5 50 20 2.000 GLU 36.79 250 0.14716 147.14 5 50 20 2.000 GLY 18.77 250 0.07508 75.07 5 50 20 2.000 ALA 22.27 250 0.08908 89.06 5 50 20 2.000 VAL 29.28 250 0.11712 117.1 5 50 20 2.000 MET 37.31 250

9、0.14924 149.22 5 50 20 2.000 ILE 32.80 250 0.1312 131.18 5 50 20 2.000 LEU 32.80 250 0.1312 131.18 5 50 20 2.000 TYR 45.30 250 0.1812 181.2 5 50 20 2.000 PHE 41.30 250 0.1652 165.2 5 50 20 2.000 LYS 45.68 250 0.18272 182.7 5 50 20 2.000 NH3 26.75 250 0.107 53.5 5 50 20 4.000 HIS 52.43 250 0.20972 20

10、9.7 5 50 20 2.000 ARG 52.68 250 0.21072 210.7 5 50 20 2.000 PRO 57.54 250 0.23016 115.08 5 50 20 4.000 CYS 60.08 250 0.24032 240.3 5 50 20 2.000 4.仪器仪器 （1）真空泵。 （2）恒温箱。 （3）水解管。 （4）真空泵。 （5）氨基酸自动分析仪。 5.操作步骤操作步骤 （1）酸水解）酸水解 称取样品（视蛋白含量）20100 mg于水解管中，精确至0.0001 g ，加入6 mol/L（0.5%巯基乙酸） 盐酸溶液10 mL，液体样品可加入等体积的浓盐

11、酸，放入冰水中冷冻35分钟，抽真空充氮气，重复三次 后，在氮气保护下封管。封管后放入1101的恒温箱中水解22小时，取出冷却。打开水解管，将水解 液转至50 mL容量瓶中，用去离子水多次冲洗水解管，合并洗液定容至刻度，用滤纸过滤，收集滤液。 （2）抽干稀释定容）抽干稀释定容 吸取1 mL滤液至10 mL抽真空集液管中，在4050下用真空泵抽干。残留物用12 mL水溶解， 再抽干，反复进行2次，最后抽干。用PH2.2缓冲溶液稀释定容，上机。 （3）仪器测定）仪器测定 仪器测定条件（参照日立L-8900氨基酸自动分析仪）： 分析柱：树脂2619，4.660 mm柱； 除氨柱：树脂2650，450

12、mm柱 流 速：A泵0.400 mL/min；B泵0.350 mL/min； 柱 温：57 反应柱温度：135 分光光度计：570 nm,440 nm 仪器分析程序：参照各仪器公司说明书 6.计算计算 0 00 9 CA FVM VA Xg/100g100 m 10 样品中氨基酸含量 （） 式中： X 样品中氨基酸含量，g/100g； C0 进入仪器测定的标准液中氨基酸的摩尔数，nmol/20L； A0 标准峰面积； A 样品峰面积； F 样品稀释倍数； V 水解后样品定容体积，mL； M 氨基酸分子量； m 样品质量，g； V0 进样量，20L； 109 将样品含量由 ng 换算成 g 的系

13、数。 7.色谱图色谱图 采用日立 L-8900 氨基酸分析仪 采用日立 835-50 氨基酸分析仪 8.注意事项注意事项 （1）称样量：对于上机的氨基酸样品浓度，L-8900 推荐的最适浓度范围为 0.410nmol/20L，当样品 浓度超过 20nmol/20L 时，铵盐可能会使得反应柱柱压增高。对已知蛋白质含量的样品，按照 16 种氨基 酸净含量总和为 2g 10g/20L 的浓度计算称样量。对于未知浓度的样品，取两支试管分别加入 0.1 mL 的样品水解液和 0.1 mL 标准溶液，再向两管内均加入 1 mL 茚三酮试剂和 1mLPH1 缓冲溶液，在沸水中加 热 3 min，测定 570

14、 nm 处的吸光度，根据吸光度，计算样品稀释倍数。 （2）水解剂的选择：最常用的水解剂是盐酸，它对蛋白质中二十种氨基酸有强的水解能力。但是对 于各种不同特殊要求的分析，需要根据某些氨基酸的特点选用不同的方法，如果对胱氨酸和蛋氨酸有特殊 要求，则要在酸中加入巯基乙酸。如果要提高酪氨酸的回收率，则要加入酚类化合物。 （3）标准液的储存：氨基酸标准液应放置于 4冰箱内保存，失效的标准液蛋氨酸、酪氨酸等的峰高 和峰面积都减小而氨峰变高，峰面积变大。 （4）缓冲溶液的配制：配制缓冲溶液时，使用一级水，过 0.45m 滤膜后使用。试剂尽可能采用优级 纯试剂或进口试剂。配制缓冲溶液只要称量准确，一般不需调整

15、 PH 值。 （5）茚三酮试剂的配制： 乙二醇独（单）甲醚易氧化产生过氧化物，因此不宜使用大包装的试剂，如：每瓶 2L 或 4L。检查 乙二醇独（单）甲醚的方法：取乙二醇独（单）甲醚 4mL 加入等体积的 4%的 KI 水溶液振摇，无颜色即 可。 茚三酮为微黄色的粉末，其中不能带有粉红色或粉红色颗粒。 由于日立 835-50 氨基酸分析仪茚三酮与茚三酮缓冲溶液是配在一瓶中的，混合后，试剂容易变化，因此 每次不宜配的过多，并且通入氮气放在冰箱内储存。 附：附： 酸水解蛋白质的氨基酸共有 18 种，除了上述的 16 种氨基酸还包括胱氨酸和色氨酸。 胱氨酸在盐酸水解过程中，水解为半胱氨酸，而半胱氨酸

16、不与茚三酮作用，不能产生颜色反应。采用 过甲酸氧化法先将样品中的胱氨酸、半胱氨酸氧化为半胱磺酸，再用盐酸水解，在氨基酸分析仪上分离染 色，测定含量。 色氨酸在蛋白质酸水解的过程中损失很大，极易被分解。因此采用碱水解蛋白质，得到色氨酸。测定 有两种方法， 一、直接测定色氨酸的天然荧光。在蛋白质水解液中，只有色氨酸和酪氨酸可以检测到荧光。在 pH 为 11 时，色氨酸的荧光强度比酪氨酸大 100 倍，且两种氨基酸的荧光相差 40nm，利用此特点，可在有大 量酪氨酸的存在下，检测色氨酸的含量。 二、碱水解后，调整 PH 为中性，在氨基酸分析仪上分离，与茚三酮染色，测定含量。 三、蛋白质与氨基酸测定结

17、果的数据关系三、蛋白质与氨基酸测定结果的数据关系 蛋白质由氨基酸组成，但二者的测定结果不能完全吻合，原因是 1.蛋白质和氨基酸测定各自在系统误差 2.定氮法测定的得到的蛋白质还包含非蛋白氮，再乘以系数得到的结果不能真实反应蛋白质的含量， 因此为粗蛋白。 根据氨基酸的测定可以计算出蛋白质的含量。 下面举例说明： 氨基酸分析结果氨基酸分析结果 nmoL/50L ng/50Lg/50Lg/50L % % 氨基酸 校正因子 峰面积 摩尔浓度 分子量浓度 浓度 上机浓度 分析结果 合计 Asp 2.01E-06 3002224 6.03 133.1 803.19 0.803 34.96 2.30 Thr

18、 1.90E-06 1427294 2.71 119.1 322.81 0.323 34.96 0.92 Ser 1.95E-06 1928822 3.75 105.1 394.29 0.394 34.96 1.13 Glu 1.80E-06 6306894 11.35 147.1 1669.94 1.670 34.96 4.78 Gly 1.36E-06 3935580 5.34 75.1 401.08 0.401 34.96 1.15 Ala 2.55E-06 1941687 4.95 89.1 440.81 0.441 34.96 1.26 Val 2.39E-06 1394969 3.

19、33 117.2 390.25 0.390 34.96 1.12 Met 1.79E-06 630994 1.13 149.2 168.71 0.169 34.96 0.48 Ile 2.51E-06 828536 2.08 131.2 272.74 0.273 34.96 0.78 Leu 1.91E-06 2659797 5.07 131.2 665.13 0.665 34.96 1.90 Tyr 1.60E-06 837641 1.34 181.2 243.30 0.243 34.96 0.70 Phe 1.92E-06 1247083 2.39 165.2 394.94 0.395 3

20、4.96 1.13 Lys 1.70E-06 1922471 3.26 146.2 476.41 0.476 34.96 1.36 NH3 6.52E-06 2038206 13.30 17.0 226.02 0.226 34.96 0.65 His 1.53E-06 1017793 1.56 155.2 241.37 0.241 34.96 0.69 Arg 1.71E-06 2340188 4.01 174.2 697.92 0.698 34.96 2.00 Pro 8.14E-06 521459 4.25 115.1 488.62 0.489 34.96 1.40 TRP 1.37E-0

21、6 2088543 2.86 204.23 584.61 0.585 202.00 0.29 CYS 8.27E-07 2954688 2.44 240.30 587.13 0.587 174.80 0.34 24.36 不含 NH3 23.71 已知样品中氨基酸的摩尔数已知样品中氨基酸的摩尔数nmol/50L计算蛋白质含量计算蛋白质含量 公式 例 nmol/50 L nmol/50 L ng/50Lg/50Lg/50Lg/100g g/100g 氨基酸 氨基酸 每分子 含 N 个 数 N 含量 N 分子 量 N 含量N 含量 上机浓 度 N 含量 蛋白转 换系数 蛋白质 含量 Asp 6.0

22、3 1 6.03 14.00 84.48 0.084 34.96 0.24 6.25 1.51 Thr 2.71 1 2.71 14.00 37.95 0.038 34.96 0.11 6.25 0.68 Ser 3.75 1 3.75 14.00 52.52 0.053 34.96 0.15 6.25 0.94 Glu 11.35 1 11.35 14.00 158.93 0.159 34.96 0.45 6.25 2.84 Gly 5.34 1 5.34 14.00 74.77 0.075 34.96 0.21 6.25 1.34 蛋白质含量 g/100g= 氨基酸分子摩尔数每分子含 N

23、个数N 分子量蛋白转换系数 100 样品上机浓度 g/50uL Ala 4.95 1 4.95 14.00 69.26 0.069 34.96 0.20 6.25 1.24 Val 3.33 1 3.33 14.00 46.62 0.047 34.96 0.13 6.25 0.83 Met 1.13 1 1.13 14.00 15.83 0.016 34.96 0.05 6.25 0.28 Ile 2.08 1 2.08 14.00 29.10 0.029 34.96 0.08 6.25 0.52 Leu 5.07 1 5.07 14.00 70.97 0.071 34.96 0.20 6.2

24、5 1.27 Tyr 1.34 1 1.34 14.00 18.80 0.019 34.96 0.05 6.25 0.34 Phe 2.39 1 2.39 14.00 33.47 0.033 34.96 0.10 6.25 0.60 Lys 3.26 2 6.52 14.00 91.24 0.091 34.96 0.26 6.25 1.63 NH3 13.30 1 13.30 14.00 186.13 0.186 34.96 0.53 6.25 3.33 His 1.56 3 4.67 14.00 65.32 0.065 34.96 0.19 6.25 1.17 Arg 4.01 4 16.0

25、3 14.00 224.36 0.224 34.96 0.64 6.25 4.01 Pro 4.25 1 4.25 14.00 59.43 0.059 34.96 0.17 6.25 1.06 TRP 2.86 2 5.73 14.00 80.15 0.080 202.00 0.04 6.25 0.25 CYS 2.44 2 4.89 14.00 68.41 0.068 174.80 0.04 6.25 0.24 总和 3.85 24.08 不包括 NH3 3.32 20.75 凯氏定氮测得蛋白质含量 25.78%，转换系数为 6.25，N 含量为 4.12%。 在氨基酸分析中，NH3主要来自于样品中非蛋白氮，从定氮法获得的 N 含量%减去从氨基酸测定获得 的 N 含量%（不包括 NH3产生的 N 含量）之差可称为非蛋白氮。 对于未知蛋白质含量的样品，可以利用氨基酸的检测数据计算样品中蛋白质的含量； 对于已知蛋白质含量的样品，可以利用上述方法进行氨基酸与蛋白质之间数据的相互审核。