《质粒提取方法.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒提取方法.ppt（23页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、质粒三种提取方法的比较,质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。 在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断
2、裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。,实验目的：,1、学会小量制备质粒DNA的碱裂解方法、 煮沸法、小量一步提取法这三种质粒DNA的提取方法。 2、三种方法的比较，能够根据不同的实验目的选择合适的方法。,实验原理：,碱变性原理 ： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲
3、液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。,闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。,变性,煮沸法：,将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100使其裂解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他
4、们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA,由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性，机械力后复性。但质粒DNA的复性要快于细菌染色体DNA。,小量一步提取法：,从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:,1、培养细菌使质粒扩增,2、收集和裂解细胞,3、分离和纯化质粒DNA,材料、设备及试剂,一、材料 含卡那酶素的E. coli DH5，1.5ml塑料离心管(又称ep
5、pendorf管), 离心管架。,二、设备 微量取液器(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。,三、试剂 1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。 3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)
6、母液：配成 50mg/ml水溶液, -20保存备用。 4、 溶菌酶溶液： 用10mmol/L TrisCl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20,每一小份一经使用后便予丢弃。5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4冰箱。 6、 溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4冰箱。
7、 7、溶液：0.2 mol/L NaOH (临用前用5-10mol/L NaOH母液稀释)，1 SDS。 8、溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。,9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L TrisCl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20。 10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键
8、的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。 11、 氯仿:按氯仿:异戊醇24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 按体积/体积1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 12、 TE缓冲液：10 mmo/L TrisCl (
9、pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4冰箱中。13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。 15、 电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 (5)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。 （2）上样缓冲液 (6)：0.25% 溴
10、酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。,操 作 步 骤,一、 细菌的培养和收集 将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50g/ml Amp)中, 37培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50g/ml Kan)中,37振荡培养约12小时至对数生长后期。,二、 质粒DNA少量快速提取 质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。,（一）、煮沸法,将振荡过夜培养的细菌1.5ml ，于8 000r/min离心1min，弃上清液。
11、将沉淀回溶于350L STET (0.1 mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。)中。 加入25L溶菌酶(10mg/mL)，放入沸水中40s，立即于10 000r/min离心10min。 吸出上清移至另一个Eppendolf 管中或用已灭菌的牙签小心地将沉淀去除，加入 40L2.5mol/LNaAc（PH5.2）和420L冰冻的异丙醇，振荡混匀，室温放置5 min。 12000g，离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗涤两次，然后将离心管倒扣在吸水纸上，使尽量干燥。 用20L无菌水溶解
12、沉淀，于20冻存,试验步骤：,（二）、碱裂解法,1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4下10000rpm离心5min。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于150l溶液中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 4、加入新配制的溶液300l, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入227l预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1
13、:1),颠倒混匀, 4下12000g离心5分钟，重复一次。 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入0.6-1倍体积的异丙醇,颠倒混匀静置10分钟，然后12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入100ul 70 乙醇洗沉淀两次。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽, 室温干燥。 10、将沉淀溶于20-50l 无菌水中，储于-20冰箱中。,1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间
14、稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 可用异丙醇(一般使用等体积), 无水乙醇（2-2.5倍体积），区别？。,注意,取0.5ml细菌过夜培养物，置1.5ml的Eppendolf管中 加入0.5ml的氯仿：异戊醇，用振荡器最大速度振荡1min，充分混匀。 12000g，离心5min，取上清移至另一个Eppendolf管中，加入500l异丙醇混匀，立即12000g，离心5min。 弃上清，加入500l70%乙醇漂洗沉淀，短暂离心。 弃上清，室温干燥沉淀2min，然后加入20l无菌水溶解DNA。,（三）小量一步提取法,1、碱裂解法提取质粒DNA时应注意哪些问题？溶液、溶液、溶液的作用？ 2、描述质粒DNA的电泳图谱，并解释产生的现象及可能的原因？,思考题,