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1、葡糖异构酶菌株筛选及固定化探究 摘要：目的筛选高产葡糖异构酶的嗜热放线菌优良菌种，并将其固定化。方法分离、诱变育种筛选出高产葡糖异构酶放线菌优良菌种，用离子交换树脂作载体进行葡糖异构酶固定化的研究。结果筛选出葡糖异构酶放线菌高产优良菌种，用离子交换树脂进行葡糖异构酶的固定化，其固定化酶活性为18 00020 000 U/g（干）。结论筛选到葡糖异构酶放线菌高产优良菌种，用离子交换树脂作载体进行固定化，所得到的葡糖异构酶酶活性较高。 关键词：葡糖异构酶；固定化；离子交换树脂 中图分类号：Q814文章标识码：A文章编号：1672-979X(2007)01-0005-04 Study on Scre
2、ening of High-producing Glucose Isomerase strains and Immobilization YUAN Jian-guo1, LI Feng2, XU Jun-qing2, TIAN Xue-wen2, DUAN Feng2, YANG Dan2 (1. Shandong Academy of Food & Fermentation Industries, Jinan 250013, China; 2. The Research and Design Center of Jinglu Bio-technology of Jinan, Jinan 25
3、0013, China) Abstract: Objective To select high-producing glucose isomerase thermoactinomyces strains and immobilize glucose isomerase. Methods High-producing glucose isomerase thermoactinomyces strains were obtained by the isolation, screening and mutation breeding. Ion exchange resins were served
4、as a supporter for the immobilization of glucose isomerase. Results High-producing glucose isomerase thermoactinomyces strains were selected. The glucose isomerase was immobilized with ion exchange resins and the activity of immobilized glucose isomerase was 18 00020 000U/g(dry). Conclusion The acti
5、vity of glucose isomerase obtained is higher. Key words: glucose isomerase; immobilization; ion exchange resin 葡糖异构酶是水溶性酶1,2，通过物理、化学的方法把这种酶固定在不溶性的固体载体上，使酶可长期多次使用，实现工业生产的连续化、自动化，并可避免不利副产品的发生，使产品更易精制，从而提高产品质量，降低生产成本3。因此，固定化葡糖异构酶具有很好的应用前景4。 1材料与培养基 1.1材料 葡糖异构酶生产菌株（本研究室从采集的土壤样品中分离得到）；树脂（自选） 1.2培养基及培养条件
6、使用无机盐、淀粉及琼脂作斜面培养基，在4550 ，相对湿度75%80%条件下培养34 d。 发酵培养基组成：麸皮4%，豆饼粉1%，MgSO4 0.1%，K2HPO4 0.1%，CoCl3 0.01%，pH6.7，115灭菌30 min后使用。发酵温度为(411)，发酵时间6065 h。发酵结束后经板框过滤得含酶发酵液，供固定化酶使用。 2方法 2.1菌种的筛选 从全国14个省市共采集2 847份样品，对产葡糖异构酶嗜热放线菌进行分离。然后将分离到的多株菌株用5种培养基进行培养，筛选出最佳的培养基。采用紫外线诱变技术处理培养的孢子，筛选最好的菌种。 2.2菌种的稳定性和安全性实验 经过较长时间的
7、保存后，观察菌株的性能和酶活性的变化情况。过滤后的发酵液送山东省药品检验所进行抗菌性检验。 2.3固定化酶载体的选择 由于离子交换树脂具有较强的吸附力和一定的离子交换能力，易于再生和反复使用，因此我们采用树脂作为酶固定化的载体5。对载体处理后通过固定化酶活性的测定，选出最佳的载体型号。 2.4固定化酶制备条件的选择 2.4.1时间称取1 g树脂，置入45 mL酶液中，相同的反应条件下，在3，5，7，9，11，13 h不同时间内取样测定酶活性。 2.4.2柱式挂酶柱式挂酶是将树脂放入柱式反应器中，保温酶液流经该柱即完成酶的固定化。基于柱式挂酶的特点，可将第1次经过反应柱的残液预处理第2根新柱，然
8、后再用新酶液处理，以提高固定化酶的活性单位及固定化收率。 2.4.3酶液量称取1 g树脂分别放入30，35，40，45，50 mL酶液中，在相同反应条件下，同时测定固定化酶的活性。 2.4.4温度称取1 g树脂加入45 mL酶液中，然后分别在50，60，65 条件下振动挂酶11 h，测定酶活性。 2.4.5不同交换基团的树脂采用不同的树脂处理方法得到不同的交换基团，然后分别与酶进行反应，测定所得固定化酶的活性。 2.5固定化酶主要性质的研究 2.5.1称取固定化酶0.1 g 6份，分别加入70%葡萄糖3 mL，0.5 mol/LMgSO40.5 mL，pH6.9柠檬酸缓冲液1.5 mL，至总体
9、积5 mL，各样品分别在50，60，70，80，85，90 条件下保温1 h，用钼蓝法测定，计算每1g固定化酶的果糖生成量。 2.5.2称取固定化酶0.1 g 5份，分别加入70%葡萄糖3 mL，0.5 mol/L MgSO40.5 mL，各样品分别加入1.5 mL pH 7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 的Tris缓冲液，至5 mL， 70 水浴条件下保温1 h进行转化，测定果糖生成量。 2.5.35份固定化酶样品分别加入含有10-1，10-2，10-3，10-4，10-5 mol/L浓度的MgSO4中，70 水浴保温1 h进行转化，测定果糖生成量，检测Mg2+对固定化酶的作用。 2.
10、5.45份固定化酶样品分别加入浓度10-1，10-2，10-3，10-4，10-5 mol/L的CoCl2中，70 水浴保温1 h进行转化，测定果糖生成量，检测Co2+对固定化酶的作用。 3结果 3.1菌株的初筛及诱变结果 对采集的2 847份样品，进行产葡糖异构酶嗜热放线菌的分离、诱变研究。紫外线单独处理孢子效果非常显著，紫外线1次单独处理孢子20 min时获得1株突变株M10336，摇瓶发酵酶活性达到350 U/mL。将M1033进一步细胞融合，得到菌株M1033-101，经摇瓶发酵，其酶活性可达到380420 U/mL。具体流程见图1。 土样：海南岛 自然分离 分离1菌株：酶活性50 U
11、/ mL 紫外线诱变 M1033菌株：酶活性350 U/ mL 纯化，细胞融合 M1033-101菌株：酶活性380420 U/ mL 图1M1033-101菌株的获得 经过较长时间的保存，M1033-101的性能和酶活性都能重复出原来的水平，因而是稳定的。发酵酶液经山东省药品检验所抗菌性检验，结果为阴性。 3.2固定化酶载体的选择 用树脂作载体，对不同型号的树脂进行了筛选，结果见表1。 表1 不同型号树脂的来源及数量 最后筛选出编号为FNS-43的强碱性苯乙烯系具有季铵基团的大孔阴离子树脂，这种树脂由苯乙烯、二乙烯苯聚合再经氯甲基胺化而成。此树脂除上述优点外，还具有耐高温，使用pH范围广，吸
12、附力强，容易再生等特点。 3.3固定化酶制备条件的选择 3.3.1制备固定化酶的时间将树脂置入酶液中，在相同反应条件下，不同时间内取样测定酶活性，结果见表2。 表2 时间对固定化酶活性的影响 由表2可见，固定化酶的活性在一定时间范围内随时间延长而增高，但当挂酶树脂处于饱和状态后，时间的延长也不能提高固定化酶活性。酶固定化时间11 h最好。 3.3.2柱式挂酶通过柱式挂酶的方式，将树脂置入柱反应器中，保温酶液流经该柱完成酶的固定化。串联柱、单柱、罐式挂酶效果比较结果见表3。 表3 串联柱、单柱及罐式挂酶效果比较 实验结果表明，串联柱挂酶比单柱、罐搅拌挂酶效率高。 3.3.3酶液量结果见表4。 表
13、4 不同酶液量中的固定化酶活性 由表4可见，固定化酶活性随着酶液量的增加而提高，但当酶液量增加到一定程度后，固定化酶活性增加渐趋减少。 3.3.4温度结果见表5。表明在60 挂酶活性最高。 表5 不同温度对固定化酶活性的影响 3.3.5不同交换基团的树脂见表6。 表6 不同交换基团的树脂对固定化酶活性影响 表6数据表明，FNS-43树脂采用MgSO4型固定化酶活性最高。 3.4固定化酶的主要性质 3.4.1固定化酶作用最适温度结果见图2。表明固定化酶的最适温度为85。 图2 固定化酶作用最适温度 3.4.2固定化酶作用最适pH上述条件下将固定化酶分别在pH7.0，7.5，8.0，8.5，9.0
14、的Tris缓冲液中，70 水浴保温1 h进行转化，测定果糖生成量。结果表明，固定化酶最适pH为8.5，见图3。 图3 固定化酶作用最适pH 3.4.3Mg2+对固定化酶的激活作用酶活性随着Mg2+浓度增高而升高，说明Mg2+对酶是有激活作用的，见图4。 图4 Mg2+对固定化酶的激活作用 3.4.4Co2+对固定化酶的激活作用在70 水浴中保温1 h进行转化，测定果糖生成量，结果见图5。酶活性随Co2+浓度的增高而增强。 图5 Co2+对固定化酶的激活作用 4讨论 从海南岛土壤中分离、诱变得到产葡糖异构酶嗜热放线菌M1033-101菌株。该菌株发酵条件要求低，高温发酵不易污染杂菌，节省冷却水，
15、并且M1033-101菌株所产生的葡糖异构酶的胞外酶占总酶95%以上，发酵液较易过滤，酶活性高，易被载体吸附，有利于固定化。因此， M1033-101菌株是一支有较高应用价值的嗜热菌菌株6。 用离子交换树脂为载体制备M1033-101嗜热放线菌固定化葡糖异构酶，实验证明，该固定化酶除具有一般的优点外，其特点是：（1）固定方法容易，设备简单，所制固定化酶酶活性可达18 00020 000 U/g，且不易污染，较稳定，易于保存；（2）固定化葡糖异构酶有较好的强度，在同一反应体系内，载体可多次再生、固定化，生产工艺简单，生产成本较低。 参考文献 1李长清，黄程芳，黎洋，等. 葡萄糖异构酶的纯化和拉曼
16、光谱J. 微生物通报，1991，18（1）：14-17. 2Ge Y, Zhou H, Kong W, et al. Imobilization of glucose isomerase and its application in continuous production of high fructose syrup J. Appl Biochem Biotechnol, 1998, 169: 203-215. 3佟毅，史立新，李惟，等. 葡萄糖异构酶的双层固定化及其在高果糖浆工业化生产中的应用J. 吉林大学自然科学学报，2000，（2）：107-109. 4Kong W, Wang L
17、P, Gao M L, et al. Imobilized bilayer gludose isomerase in porous trimethylarnine polystyrene based on molecular depositiion J. J Chem Soc Chem Commun, 1994, 28:1297-1298. 5朱祥瑞，徐俊良. 家蚕丝素固定化葡萄糖异构酶的制备方法及其理化性质J. 蚕业科学，2002，（3）：238-241. 6黄婉治，王淳，刘兢，等. 链霉菌M1033葡萄糖异构酶的分离纯化及其性质研究J. 中国科技大学学报，1992，22（3）：253-289. 注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。” 10