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1、8 2 0 0 5 . 0 5 高效液相色谱仪使用过程中常见问题 及其解决方法 陈莲 高洪 肖啸 （云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 6 5 0 2 0 1 ） 高效液相色谱 （h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , H P L C ） 技术是近3 0 年发 展起来的一种具有高灵敏度、 高选择性的 高效快速分离分析技术。 它既能用于微量 组分的分析测定， 又能用于大量的制备分 离， 手段灵活多样， 其应用范围已超过其 它各种分离方法， 尤其在生化医药样品的 分析分离、 食品卫生安全检
2、验等方面更能 充分发挥它的特长， 为推动这些领域的进 步和发展作出了巨大贡献。 液相色谱在使用过程中常会出现一 些影响分析结果的小问题， 如果使用人员 了解了常见问题及其成因和相关解决方 法， 能做到早预防勤维护， 使分析结果保 持较好的稳定性与较高的精确性。 1 液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、 泵、 进样 器、 色谱柱、 柱温箱、 检测器、 数据处理系 统组成。 对于整个系统而言， 色谱柱、 泵和 检测器是核心部件同时也是容易出事故 的主要部件。 2 常见问题及解决方法 2 . 1 针对柱压问题 柱压变化是使用高效液相色谱过程 中需要密切注意的指标， 柱压的稳定与色 谱图峰形的好坏
3、、 柱效高低、 分离效果及 保留时间等密切相关。 所谓柱压稳定并不 是指压力值稳定于一个恒定值而是指压 力波动范围在5 0 P S I（针对W a t e r s 高效液相 色谱仪） 之间。 压力过高、 过低及波动较大 都属于柱压问题， 但柱压的高低与色谱柱 的种类、 品牌、 液相系统本身及使用的流 动种类相关。 值得注意的是在使用梯度洗 脱进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。 一般而言， 柱压变化最先考虑的是 柱子， 在排除柱子因素后再考虑其它因 素。 在实际应用中常见柱压问题可从以 下几个方面来考虑 （见表1 ） 。 2 . 2 针对保留时间漂移的问题 保留时间的改变是很多液相色谱仪 使用者常
4、碰到的问题， 包括了保留时间的 延长或缩短。 它的产生与很多因素有关， 可从以下方面进行考虑 （见表2 ） 。 图1 液相色谱仪工作系统及流程 动物科学 2 0 0 5 . 0 5 9 小型猪是当前医学研究的理想动物模型 更换新的色谱柱。 重新设定正确流量。 不同配比的流动相其粘度系数不相同， 较高粘度的流动相 相应的系统压力也大。 如果可能， 可考虑更换成粘度较小的溶剂 或重新设定配比。 调节压力传感器的零点。 折下后进行超声波清洗或更换新的阻尼器。 参见说明书进行清洗。 更换被堵塞管路或按说明书方法进行清洗。 与供应商联系， 进行维修。 检查储液瓶中有无流动相、 沉子是否浸没在流动相中、
5、泵 是否运行。 检查各部件的连接点， 进行再次固定。 将流速降低后关闭参比阀， 一般降至0 . 1 0 . 2 m L / m i n 后关 闭参比阀。 新进行排气操作( 可重复多次， 直至气泡排出) 。 将沉子取下后进行超声波清洗， 可先用纯水再用甲醇进行 清洗。 色谱柱被堵塞 流速设定不正确 流动相配比不正确 系统压力零点飘移 阻尼器堵塞 进样器堵塞 管路或连接口堵塞 压力传感器故障 没有流动相流出 系统存在漏液 参比阀未关闭 系统管路中存在气泡 沉子表面的小孔被堵 柱压升高 柱压升高 柱压升高 柱压升高 柱压升高 柱压升高 柱压升高 柱压升高或降低或无柱压 柱压降低或为零 柱压降低 柱压
6、降低或没有柱压 柱压不稳定重 柱压在较大范围内波动 表1 影响柱压稳定的原因及解决方法 温度变化 流量变化 流动相的问题 色谱柱被污染 梯度滞后时间设置不正确 色谱柱使用问题 系统不平衡 设定一个恒定的温度， 而且当室温较所需温度低时要注意提高柱温的设定 值 。 在正确使用流动相与流速的前提下检查泵是否存在问题， 比如漏液与在线混 合的准确性。 流动相预混合避免在线混合不均匀。 使用预混合则要注意每次配液的准确性、 精密度与p H 值的变化； 流动相被污 染或加入添加剂后可能对待测组分存在干扰。 正/ 反相冲洗色谱柱或更换新色谱柱。 检查泵和流路系统维护记录， 确定系统最后使用之后有无调整。
7、如果有变 化， 重新计算新的梯度滞后体积。 不同的色谱柱尺寸与填料对同一物质的保留时间是不同的， 同一批样品最好 使用同一色谱柱进行分析。 应使用充足时间来平衡整个系统， 特别在色谱柱第一次使用离子对试剂时， 要有充足时间和流动相体积来平衡色谱柱。 每次开机使用时平衡时间至少为0 . 5 1 h ， 在改变流动相时也需要0 . 5 h 来重新平衡柱子。 2 . 3 针对异常色谱峰问题 异常的色谱峰指的是色谱图中无峰 或出现负峰、 宽峰、 双峰、 肩峰、 峰形不对 称等情况。 具体情况与原因分析如表3 。 3 高效液相色谱仪的保养 3 . 1 H P L C 的日常操作条件 工作温度： 1 0
8、3 0 ； 相对湿度 问 题 出现现象解决方法 可能原因解决方法 表2 保留时间漂移的问题及解决方法 8 0 ； 最好是恒温、 恒湿环境， 远离高电 干扰、 高振动设备。 3 . 2 泵的保养 1 ) 使用流动相尽量要清洁， 流动相要 过滤后再用； 2 ) 进液处的沙芯过滤头要经常清洗； 3 ) 流动相交换时要防止沉淀； 4 ) 避免泵内堵塞和进入气泡; 3 . 3 进样器的保养 每次分析结束后， 要反复冲洗进样 器及进样针， 防止样品交叉污染； 3 . 4 柱的保养 1 ) 柱子在任何情况下不能碰撞、 弯 曲或强烈震动； 动物科学 1 0 2 0 0 5 . 0 5 2 ) 当柱子和色谱仪连
9、接时， 连接处 和管路一定要清洗干净； 3 ) 流动相一定要脱气后再使用； 4 ) 避免使用高黏度的溶剂作为流动 相， 同时要避免使用强酸强碱做流动相； 5 ) 待分析样品要过滤、 纯化； 6 ) 严格控制进样量； 7 ) 每天分析工作结束后， 要清洗进 样阀中残留的样品； 8 ) 每天分析测定结束后， 都要用适 当的溶剂来清洗色谱柱； 9 ) 若分析柱长期不使用， 应用适当 有机溶剂保存柱子并将其封闭； 3 5 检测器( U V ) 的保养 1 ) 紫外灯的保养： 在分析前， 柱平衡 得差不多时， 打开检测器； 在分析完成后， 马上关闭检测器， 减少紫外灯的使用。 2 ) 分析完后， 样品池
10、要严格进行清 洗。 3 6 对整套仪器的保养 对经常使用的仪器要按以上操作对 各部件进行维护与保养。 对常期不用的仪 器要定期开机运行， 最好每周开机2 h 左 右， 以便对其性能及潜在问题能及时了 解。 4 结语 在高效液相色谱仪使用过程中故障 排出时要遵守以下原则： 一次只改变一个 因素， 从而确定假定因素与问题之间的联 系； 如果通过更换组件来排查故障时要注 意将拆下的完好组件装回原位， 从而避免 浪费； 养成良好的记录习惯， 一个良好的 记录是成功地进行故障排除的关键。 总之， 在使用高效液相色谱仪时一 定要注意样品的前处理与仪器的正确操 作和保养， 仪器系统的干净是用好仪器和 维护维
11、修仪器的关键。 表3 异常的色谱峰及问题分析 出现情况 问题分析 色谱图中无峰 出现一个或几个负峰 均为负峰 均为宽峰 色谱峰比预想的小 出现双峰或肩峰 前伸峰 拖尾峰 出现平头峰 出现鬼峰 系统未进样或样品被分解； 泵未输送流动相或流动相使用不正确； 检测器设置不正确。 针对以 上情况成因作相应调整即可。 流动相吸收本底高； 进样过程中进入空气； 样品组分的吸收低于流动相的吸收。 信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒； 光学装置尚未达到平衡。 系统未达到平衡； 溶解样品的溶剂极性在于流动相极性； 色谱柱尺寸及类型选择不正确； 色谱柱 或保护柱被污染或柱效降低； 由于温度变化所产生样品粘度过大
12、； 进样器故障或进样体积误差； 检测 器设置不正确， 定量环体积不正确； 检测池污染； 检测器灯出现故障。 进样量过大； 样品浓度过高； 保护柱或色谱柱柱头堵塞； 保护柱或色谱柱污染或失效； 柱塌陷或形 成短通道。 进样量或样品浓度过高； 溶解样品的溶剂极性较流动相极性强； 保护柱或色谱柱污染或失效。 柱超载， 降低样品量， 增加柱直径， 采用较高容量的固定相； 峰干扰， 对样品进行清洁过滤， 调整流 动相种类或配比； 排除硅羟基础作用， 可加入三乙胺， 用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动 相p H 值； 柱内烧结不锈钢失效， 更换烧结不锈钢， 增加在线过滤器， 对样品进行过滤； 死体积
13、或柱外体 积过大， 将连接点降至最低， 尽可能使用内径较细的连接管； 柱效下降， 通过更换柱子， 采用保护柱， 对 柱子进行再生来改善。 检测器设置不正确； 进样体积太大或样品浓度太高。 可能为上次样品的残余。 在每次进完样后需要用充足的时间来平衡和清洗整个系统； 样品中存在 未知物， 改进样品的预处理； 流动相污染， 更换新流动相， 尽可能做到流动相现配现， 隔夜的流动相应 放入冰箱储存再次使用时要进行过滤， 尽可能使用H P L C 级试剂。 恒温冰箱数显17 80L1600.00 恒温水浴锅数显 4孔700.00 显微镜640倍450.00 恒温载物台恒温480.00 磁力搅拌器数显 加
14、热450.00 双蒸水机2L/h 上海2000.00 输精管成套含瓶1.00 移液器100ml可调100.00 稀释粉台湾50克13.00 精子密度仪721梂3100.00 测孕仪美国进口2560.00 假母台高度可调600.00 本期特别推荐 大鸿畜牧与世界同步 养猪设备专业设计制造商 单 位 ： 北 京 大 鸿 畜 牧 工 程 中 心 地址： 中国农业大学西区 电话： 0 1 0 - 6 2 8 1 7 4 7 4 6 2 8 1 8 4 7 4 1 3 6 0 1 2 7 2 6 1 0 1 3 3 1 1 1 8 9 2 9 4 传真： 0 1 0 - 6 2 8 1 5 4 7 4 6 2 8 9 6 3 5 8 网址： w w w . d a h o n g . n e t . c n w w w . d a h o n g . n e t . c n 动物科学