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1、不同温度时未激活的秋大马哈鱼受精卵的影响经过冷冻处理以及解冻处理的鱼卵或胚胎，其生存能力的成功保存，为野生种群的驯化及鱼类养殖开辟了新的前景。其对遗传学的研究、增进和保护受到危害的种群，对遗传物质定期的独立分配具有普遍的用处。受精的继鱼卵的过冷保存，国外有很多报道，通过对蛙鱼受精卵过冷保存的研究，为扩大蛙鱼的放流量，进行大规模的江河放流探索了一条新路。至今冷冻保存鱼卵或胚胎的尝试还限于大西洋鲜（Clupea harengus），硬头礴（Salmo gairderi）溪红点蛙（Salue linusfontinalis）蛙（Salmo salar）和欧蹲（salmo trutta），本实验对未进
2、行水激活的秋大马哈鱼受精卵进行冷冻试验，观察了在不同温度下对受精卵孵化效果的影响。材料和方法：蛙鱼卵和精液均取自乌苏里江成熟的秋大马哈鱼（通过解剖的方法获得），采用人工授精的方法获得受精卵，受精时的温度为8，将未进行水激活的受精卵展成一层，放置在室温条件下，2小时之内使用。卵与精子均筹自3一9尾鱼。保存液用鱼Rinoer液（表1）其渗透压为250mosg/L,pH值为8.04.本试验分为四组，其分别为一6、一10、一15和室温组。每组样品由10个20ml安瓶构成，每个安瓶中含有7粒卵（平均重量为 0.14g/粒），使卵在瓶底形成一层。用长方检验处理各组结果。在放入含1 M的DMSO保存液中之前
3、，以每次0.25M浓度逐级增加至1M,每增加一级平衡孵育5min,在最终浓度内平衡10min.采用同样的步骤进行DMSO的稀释。在放入DMSO之前或之后，在无DMSO的鱼Ringee液中平衡5min.我们对完整的卵细胞进行了过冷点与冰点的测定，采用铜一康铜温差电偶记录过冷点和冰点的温度，指示部分采用国产AC15/2型直流复射式检流计，配备国产ZX21型旋转式电阻箱。降温系采用自制简易降温仪（图1），致冷剂为碎冰和食盐的混合物，其原理是通过致冷剂冷却烧杯内的酒精，从而使样品致冷。由半导体温度计测量保存液的温度。在进行冷冻前与冷冻后，均以每5min增加或减少0.25M的步骤平衡受精卵（室温），而后
4、放到简易降温仪内降温，降温曲线如图2所示。冷冻所达的温度分别为一6，一10，一15，并在其最低温度内保存10min.冷冻结束后，以1020/min的复温速度解冻鱼卵（8），经过DMSO平衡之后移入水中激活，2小时后计数其直接成活率，孵化至发眼期，计数其发眼卵数。冷冻卵活力的签定标准为：卵对水的活性或变硬处理有反应，则认为卵是活的；变得透明，不发生机械变形和产生卵周隙的卵，被认为是变硬的卵。结果：1.冷冻对受精卵孵化效果的影响：在未冻结的保存液内，卵的外形直观上无变化，但当保存液有冰晶产生时，有些卵变白，解冻时，这些卵又变得清晰，但移到水中激活后，这些卵又重新变白。没有变化的卵，经水激活后形态正
5、常。经冷冻保存之后的卵，透明度增高，卵细胞内，油滴多聚集在动物极之侧。冷冻实验由于系分批进行，故全部实验数据均与相应的对照值相关。冷冻组的样品从室温降至一5这一阶段，含有冷冻保护剂的保存液并未冻结，在保存液内形成冰晶时，温度上升至一4左右，其所持续的时间在1min之内。样品的中心重新冷至所需温度是以一0.2/min的速度进行的，并在最低温度保存l0 min,结果见表2.2.过冷点与冰点的测定：本试验所测得的过冷点是不恒定的，其值均在 -7.5以上；但其冰点值均在-1.7 -1.8之间（表3）。讨论此次实验全部采用没被水激活的受精卵，据鱿鱼（Salmo Salar）的研究，就水透过卵黄外周膜而言
6、，未激活比激活的卵渗透系数高，由此可知，冷冻期间未激活的卵可能脱水较好，因而胞内冻结而引起损害的几率最小。此外精子与卵子的细胞质接触后，由于未激活的卵受精过程被阻滞，所以这些卵子具有统一的发育期。Zell、Erdahl和Grahum也曾用受精、但未激活的卵作冷冻研究。受精卵在体腔液或鱼Ringer液中保留有受精性，尽管在鱼Ringer液中能够受精，但只有将其移到新鲜水中时它才有活性和变硬。渗透压对受精卵的影响，可采用的资料有限，但从B、Harvey（1983）和J、Stoss（1983）的资料来看，其维持在240一450mosm可耐受24小时。本次试验我们所采用的鱼Ringer液的渗透压维持在
7、250mosm左右。冷冻前和冷冻后添加DMSO的主要目的是防止渗透冲击，使抗冻剂充分渗透。抗冻剂的穿透性与该物质的分子量是成反比的。J、Stoss（1983）证明：冷冻前DMS0在2 M和4 M对银大马哈鱼卵有害，几乎不能存活，但含2 M的DMSO样品被冷冻至一11.8时，仍可观察到部分卵活到发眼期。逐步增加DMSO的浓度，可以减少或消除不利影响。冷冻保护剂可使细胞脱水时间更长，延缓细胞内冰的形成。现普遍认为IM的DMSO效果似乎较好，故此，我们所采用的DMSO浓度亦为1 M。Harvey和Smith（1982）测得硬头缚卵的内容物和完整卵的冰点近似，其值均为一1.7，这与我们的结果相比是一致
8、的。很多类型的细胞质在一1便结冻。蛙鱼卵的冰点较低，无异是由它们卵黄内容物高的缘故，过冷点值的不恒定，是与降温速度有关，降温速度越快，过冷状态越不稳定，过冷点越小，反之也是如此。冷冻和解冻期间，存活率减少的主要原因是细胞内冰形成，而冷冻程序主要在于充分地脱去细胞内的水分，使细胞内冰形成的几率减至最小。稀释液与卵细胞自然冻结的温度为一4，这与Harvey和Smith（1982）所得的结果是相近的。在一6DMSO有效地保护了结冰过程中的受精卵，然而进一步冷却至一15多数细胞内结冰，这说明所用的冷却速度使细胞脱水不充分，Mazur指出：适宜的冷却速度和细胞的直径大致是相关的。故此，我们所用的降温速度
9、可能是不适合的。Zell（1978）在没有抗冻剂的情况下，以5/min的冷却速度将溪红点蛙受精卵降至一5，孵化率为20%,在含有抗冻剂（8%DMSO,10%PVP）的情况下，在相同条件下获得70%的存活率，Erdahl和Graham（1980）以5/min降温速度，在一20保存，持续时间不清，含14%DMSO或14%甘油的保存液中在16粒欧傅鱼卵中获得69%的发眼率，但在更低的温度下，没有获得成功。由于Zell（1978）每次试验使用的卵量较多（75750），卵置于最低温度不到5 min,这样，样品内可能会产生温度梯度，中心温度可能未达到最低温度，所以这些结果与我们的资料相比是困难的。在我们的
10、研究中多数卵细胞内冻结，因此在含有DMSO的保存液结冰之后，在一10一15之间坏死，与Stoss（1983）的结果是较相近的。Harvey和Smith（1982）的研究结果也表明，在10%的DMSO的清况下，保存硬头蹲卵在一16，鱼卵细胞内亦结冰。最低温度时的存活率也是一样不能保证以后的发育率，这一点在我们的资料中也可体现出来。总的来讲，寻求更慢的降温速度与合理的改变解冻速度及实验程序，使细胞内脱水更充分，可能使鱼卵的冷冻获得进一步的成功，有待于新的探索。参考文献：1 J.Stoss and EMDonaldson（李禾译）：Aquaeulture1983,31（1）：51652 Brian
11、Harvey and MJ Ashwood Smith: Cryobiology 1982,19（1）：29403 Brian Harvey ,et al: Can Teeh Rep Fish Aquat Sei 1983, 1222:194 李楚杰：冷伤人民卫生出版社。1980,48一505 Ginsburg AS: J.Embryol ExP MorPhol 1963, 11:13336 Zell SR:Ann Biol Anim Bioehim BiaPhys 1978, 18:108910997 Erdahl, DA, and Graham, EF: In Proeeedings International Conferenee on Animal ReProduetion and Artifiecal Insemination, 1980; 3173268 Mazur, P: Cryobiology 1977,14:2512729 Mazur, P: Cryobiology Seieoee 1970, 168:939949