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1、实验 酿酒酵母的大规模液体发酵生产,实验原理,本实验通过对15升中型发酵罐的了解及使用，将整个微生物发酵生产过程分成几个阶段，系统的表现了发酵生产工艺流程，包括使用发酵设备前期整个设备给水、给无菌空气、给高压蒸汽管路及其排放管路的了解，以及在实际操作过程中各个管路之间的切换，发酵用各个检测设备的标定。并以酿酒酵母的纯化培养开始、再进行摇瓶放大、最后实现发酵罐的发酵生产的具体实验过程，让学生学会在发酵过程中能够分阶段的进行采样检测，根据检测值对发酵的条件进行必要的调节，最后对于发酵所得到的产物进行必要的分离纯化，制成成品并保存，从而掌握整个发酵生产工艺流程的具体实施过程。,实验简介,15升发酵罐
2、图示,发酵罐罐路示意图,管路说明,一、空气及其净化 来自空压机的压缩空气经净化器（外接减压稳压器、除水、除尘、空气预过滤器）进入发酵罐空气总管，空气流量计A01、阀A02、单向阀、空气过滤器、阀A03到达反应器内，尾气经阀排出，本管路具有计量、净化作用。注：空气流量级显示的流量是以过滤器前的压力下的流量，不是标准状态下的流量。 二、蒸汽 蒸汽进夹套 蒸汽经阀S01进入夹套（上进），经阀V01排出冷凝水。蒸汽对培养基预热。 蒸汽进反应器 蒸汽经阀S02、单向阀、空气过滤器、阀A03进入罐内，由排气口控制阀VT1排出。蒸汽对过滤器及空气管线消毒。 蒸汽进取样阀及放料阀 蒸汽经阀S03进入取样阀，由
3、阀P02排出冷凝水。蒸汽对取样阀及底阀灭菌。 三、自来水 自来水进夹套 当电磁阀C01打开时，自来水经自动注水阀、阀W01进入反应器夹套（下进），由夹套上口、阀W02、加热器、电磁阀C01排出；当电磁阀关闭时，夹套水经W02进入电加热器、循环泵、单想阀进入夹套（下口），通过夹套水的循环，将加热器的热能带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。注：温度自动前必须对夹套注水 自来水进排气冷凝器 自来水经阀W03进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却尽可能减少培养基的水分蒸发。,实验步骤,一、发酵前的准备工作 1酵母菌活化：由种子活化到试管斜面上。 2按照下列配方配制麦氏（Meclary）培养基300ml，1
4、13灭菌20min。 将300ml种子培养液分成两份，无菌操作取酿酒酵母菌斜面菌苔，接种于种子培养液，摇床培 养2448小时。,3补料液的配制及灭菌：配制0.2mol/L NaOH溶液、0.6mol/L HCl溶液、食用油分别装入补料瓶中，将连在补料瓶上的橡皮管，用绳子扎紧，121灭菌20min。 4培养基的制备：酵母膏25g、NaAc82g、KCl 18g、葡萄糖10g。加水溶解搅拌均匀。,5溶氧电极标定： 零点标定：将电极拔出浸没于饱和的无水亚硫酸钠溶液中，待电极显示值稳定后标零点1。斜率标定：溶氧电极的斜率（满度）标定一般在发酵之前，温度、罐压、通气量均在正常情况下进行，一般以100标定
5、，因为它是个相对值，也可以是其他数值，罐压对溶氧量影响较大，标定时应保持罐压相对稳定。 6pH电极标定： pH电极零点和斜率不能在发酵状态下标定，只能在灭菌以前进行，但可以在发酵过程中进行零电位补偿。标定前电极需泡于液体中并已联机1小时以上，通常采用两点标定法：先将电极洗净擦干，然后浸入6.86缓冲液，并将零点标定值设为6.86，然后按开始标定键，待pH显示值稳定后可按零点标定结束键，然后洗净擦干电极后同样方法标定斜率，然后再标定零点，反复至更换缓冲液时，pH未经标定已达标准值（附近）即可。 7蠕动泵流量标定 蠕动泵的标定随时可以进行。可以对酸、碱泵、补料泵、消泡剂泵进行标定，方法相同。先取定
6、量的液体，安装好，然后在标定画面上设为标准容量。然后将手、自动开关调节到手动位置，使泵运转并将管内空气排出开始滴液，将出口液体滴入标准容器，同时按标准开始键并确定，此时开始以秒为单位计数，待输出液体到达设定的标准容量时，再按确定。整个标定过程结束。此时，加料速度便由控制器显示出来。标定结束后将开关置于“关”的位置。 8将4步骤配制好的培养基加入发酵罐中，加水至体积约11.5升（防止水蒸发过多）。,二、实罐灭菌操作,1、准备 盖紧罐盖上的各种盖帽，旋紧罐盖上的压紧螺栓， 关紧发酵罐底阀P01，倒入培养基，调整pH值，旋紧接种口。 关排气冷凝器进水W03，移去进出口的软管排尽冷凝水夹套中的水,2、
7、培养基预热 准备工作 预先启动蒸汽发生器及空气压缩机。 将控制器中的温度控制设定为手动 开排气阀VT1，关闭其他所有阀们 开排气阀VT1，开夹套冷凝水阀V01排夹套水，关闭其他阀门。 启动反应器搅拌马达。调节转速200-300rpm。 蒸汽进夹套：缓慢开夹套蒸汽阀S01蒸汽进夹套（注意：此时有轻微爆破声属正常，如声音过响，则开阀速度应减慢）。待排水总口排出蒸汽时调节冷凝水阀V01，控制蒸汽排出量以有少量蒸汽冒出即可。并控制夹套内压力不要超过0.2MPa。当培养基预热至98时，进入实罐灭菌操作。在培养基温度在80-90时可以适当的减慢升温速度，在本温度区域可以杀灭大部分微生物。 蒸汽进取样阀：开
8、出料阀P02（关紧底阀P01），开蒸汽阀S03，蒸汽进入取样阀内腔，当阀P02 排尽冷凝水后应调节其开度，以少量蒸汽排出即可。,3、实罐灭菌 蒸汽进过滤器：停搅拌，微开过滤器上排冷凝水阀V02，开过滤器前蒸汽阀S02，微开过滤器后排冷凝水阀V03，缓缓开切断阀A03，蒸汽经过过滤器进入反应器，当冷凝水阀V02、V03出口冷凝水很少时，调节冷凝水阀V02、V03以有少量蒸汽排出为宜。当排气口有蒸汽排出或罐温到达100两分钟后，关闭排气阀VT1。调节切断阀A03和蒸汽阀S02，维持过滤器前蒸汽压力为0.12-0.16MPa，同时必须保证切断阀有一定开度，不得关死。当罐温达到100时，培养基中的溶氧
9、接近零，可以标定溶氧的零点。 当达到预定温度或罐压，开排气阀VT1至有少量蒸汽排出，关紧或微开夹套蒸汽阀S01，微开底阀P01（开阀时观察视镜处培养基翻腾的变化，以有少量变化为宜），根据罐压或罐温变化的趋势。及时调节蒸汽阀S02、S03。阀门调节应微调，避免大幅度开关。当反应器罐压或罐温维持在预定的范围内开始计时。 保温开始后，排气阀蒸汽排量不宜太小，否则可能导致液面以上的罐体部分尤其罐盖达不到消毒温度。 保温阶段应旋松接种口盖至有少量蒸汽冒出。,4、灭菌完成及降温（先开后关，后开先关） 保温结束后首先旋紧接种口盖。旋紧罐底阀P01，再关紧取样器的蒸汽阀S03。 关紧空气管线切断阀A03及冷凝
10、水阀V03，关紧过滤器前蒸汽阀，全开空气阀A01、A02，开冷凝水阀V03用空气吹过滤器，当罐压接近0.05MPa时关闭阀V03，缓缓开空气管线切断阀A03，空气进入发酵罐。当过滤器冷凝水阀V02排尽冷凝水后就可以关闭 关夹套蒸汽阀S01、冷凝水阀V01，开夹套进水阀W01和循环管线切断阀W02。在控制器中将温度控制方式设定为“自动”，发酵罐进入自动降温阶段。按下搅拌开关，设定搅拌转速并“自动”控制。 在降温过程中，始终监视罐压，严禁压力掉零。当温度到达工艺要求时，调节搅拌转速、空气流量、罐压、标定溶氧电极斜率及校正pH电极的零点。,三、接种,调节进气量至3001000L/h，开排气阀至罐压接
11、近于0（不得大于0.2kg/cm3），放松接种口，在火焰保护下打开接种口，迅速将种子倒入，旋紧接种盖，立即调高罐压，在控制器的初始化菜单中设定发酵批号，并开始进行发酵。,四、补料,将灭菌消毒的补料瓶放好，手动安装好输液管，使中间接头嵌在蠕动泵凹槽内 用酒精棉球擦拭罐盖补料口，打开盖后将针头迅速插入并穿透密封盖。 打开蠕动泵手动开关，使料液管中充满料液，置开关为自动。,五、发酵及取样检测,取样器消毒：半开阀P02，开蒸汽阀S03，蒸汽进入取样器，消毒时间5-10分钟。 关蒸汽阀S03，全开出料阀P02，准备取样。 逆时针转动取样阀P01手柄，进行取样。回转手柄。 开蒸汽阀S03，冲洗取样器，关阀S03。取样结束。,放料 发酵完毕通过取样口放料。 离心 以5000r/min，离心5min，取下层沉淀。将沉淀反复水洗，至上清颜色变淡 超声波破碎 将沉淀用水溶解后用超声波3s间隔2s进行30次，再离心取上清液，即所有提取的菌体蛋白。-40冷冻保存。 使用冷冻干燥机冷冻干燥制得蛋白质干粉。,六、发酵后处理,