重组体的筛选与鉴定.ppt

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1、,黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。,黏性末端连接法不足之处有： (1)载体易自身环化； (2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆； (3)难插入特定的基因； (4)再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向； (5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。,第六章 重组体克隆的筛选和鉴定,转化子和重组子,转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子,重组子：含有重组DNA分子的转

2、化子成为重组子。 如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望克隆子,选择 (selection) 筛选 (screening) 选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。 筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交以及免疫测定，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正是所需重组DNA分子的特定克隆过程 由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使用高度敏感和高度特异的筛选方法。,根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛选，所有正常的噬菌斑都

3、是重组体；当使用pUC系列载体时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。 有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。,一、抗药性标记及其插入失活选择法,pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基

4、因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。,第一节 载体表型选择法,1. 原理：,pBR322,（1）四环素：,（2）氨苄青霉素抗性基因：,2. pBR322抗菌素标记选择,含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,（3）环丝氨酸：,3. 选择过程：,如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。,Tetr失活的

5、菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（1）四环素抗性插入失活,无环丝氨酸培养基,（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。,二、-半乳糖苷酶显色反应选择法,-半乳糖苷酶,乳糖,半乳糖,葡萄糖,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,+,+,深蓝色,1. 原理：,载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基

6、因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。,假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数或没有终止密码；（不破坏肽）。,2. 选择过程,-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。,利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,一、原理：,第二节 根据插入基因的表型选择,1.弥补缺陷,his-,his+,受体菌：,外源基因：,在不含组氨酸的培养基中生长,小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。,DHFR,载体,连接,转化受体菌,三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板,含DHFR的克隆才能生长,例：,

7、使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,2. 增加新性状,降解,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,一、直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,第三节 DNA电泳检测法,分子量 Marker,载体,重组克隆,二、酶切电泳筛选法,1. 原理：,根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。,或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。,酶切前,酶切后,插入片断,载体,A,B,A或B,不同克隆的酶切结果,筛选过程,三、PCR扩增检测法,1. 原理,

8、PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。,2. 过程,（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。,（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。,（3）电泳PCR产物。,（4）检查是否有PCR产物。,（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。,1. 核酸杂交,第四节 核酸杂交检测法,一、原理：,重组克隆与探针杂交。,3. 识别标记,32P 或 125I 。,（1）放射性同位素,2. 检测用的探针,与外源DNA插入片断互补的序列。,（2）非放射性标记,荧光素,二、核酸杂交检测方法,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。,1. Southern blotting,从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），

9、再用探针杂交。,只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。,酶切前,酶切后,插入片断,载体,Southern blot 筛选结果,（1）原位杂交筛选,特点：,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,（2）R-环检测法,DNA-RNA杂交。,1）原理：,2）选择过程,在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。,用外源基因的mRNA与重组载体杂交。,缺点：需要电镜！,2. Northern blotting,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主

10、细胞中提取RNA，再用探针杂交。,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,一、放射性抗体检测法,第五节 免疫化学检测法,1. 抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二 抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,125I标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二抗 结合蛋白,125I标记的二抗,2. 放射性抗体检测法过程,3. Broo

11、me-Gilbert双位点检测法,质粒基因A,插入基因B,表达,质粒蛋白A,外源蛋白B,融合蛋白,检测融合蛋白。,既检测外源基因产物又检测载体基因产物。,固相支 持滤膜,抗A抗体,125I标记的 抗B抗体,质粒蛋白A,外源蛋白B,质粒蛋白A,外源蛋白B,固相支 持滤膜,抗A抗体,发光，底片曝光,二、免疫沉淀检测法,把非放射性抗体加到平板培养校?/b当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。,1. 原理,抗原抗体凝集反应。,检测分泌型产物。,2. 方法,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,三、酶联免疫吸附测定（ELISA）

12、,Enzyme-linked immunosorbant assay,1. 原理：,一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,19,2. ELISA检测的一般步骤,（1）固定样品,将待测样品加入96孔微量滴定板（microt

13、iter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。,孔底,加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。,（2）一抗结合,一抗,加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。,二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。,（3）二抗结合,二抗,加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。,（4）显色反应,在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。,（5）比色,3.ELISA的局限性,有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。,最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）,临床检验常用的单抗,四、免疫印迹

14、（western blotting）法,1.原理：,在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。,（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。, SDS:,（SDS-PAGE）：, 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：,（Polyacrylamide gel electrophoresis）,在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。,电泳buffer,电泳buffer,点样,电泳方向,蛋白质电泳的分子量标准,已知分

15、子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,商品化供应,Da,道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为61023道尔顿,Dalton,SDS PAGE,凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。,硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。,2）转到膜上进行染色。,1）直接染色,直接染色电泳结果,（2）Western blotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。, Western（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。,膜

16、,胶,蛋白,Western装置, Blotting,原理与ELISA相同。,待测蛋白,硝酸纤 维素膜,一抗,二抗,辣根过氧 化物酶,底物,产物， 并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：HRPO,1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。,2）洗去未结合的一抗。,3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。,4）清洗掉未结合的二抗。,5）用HRPO的底物浸泡膜。,6）暗室里曝光，冲洗胶片。, Blotting过程,Immuno Blotting,结果,多克隆抗体Blotting的结果,单抗blotting结果,一、无细胞翻译系统,第六节 转译筛选法,能把外源的m

17、RNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。,借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。,适用于mRNA转录丰度高的外源基因。,二、转译筛选,mRNA,无细胞翻译系统,35S标记的 甲硫氨酸,翻译,35S标记的肽链,PAGE电泳,放射自显影,比较放射性 带纹的位置,载体+外源DNA,转录,与预期的产物分子量相符？,三、杂交抑制转译法,mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。,单链mRNA,核糖体 小亚基,核糖体 大亚基,能翻译,mRNA,DNA,核糖体 小亚基,

18、核糖体 大亚基,不能翻译,1. 原理,2. 过程,四、杂交释放转译法,1. 原理：,在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。,2. 过程,硝酸纤 维素滤膜,载体和插 入的cDNA,总mRNA,cDNA基因的 mRNA,杂交,洗脱,cDNA基因的 mRNA,体外翻译,cDNA编码的蛋白,电泳,凝胶放射自显影,cDNA编 码的蛋白,硝酸纤 维素滤膜,载体和插 入的cDNA,硝酸纤 维素滤膜,载体和插 入的cDNA,收集,35S标记的氨基酸,专门设计检测能同DNA

19、特异结合的蛋白质因子。,待测蛋白质,硝 酸 纤 维 素 滤 膜,能与蛋白质结 合的DNA序列,放射性标记,待测蛋白质,硝 酸 纤 维 素 滤 膜,能与蛋白质结 合的DNA序列,放射性标记,五、DNA-蛋白质相互作用筛选法,一般克隆与筛选策略,第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法,真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。,二氢叶酸,四氢叶酸,二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）,一、哺乳动物基因转移的选择标记,1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk）,（1）TK选择原理,四氢叶酸的必要性,DHFR,氨甲喋啉（Methotrexate

20、）的抑制作用,氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成：,胸苷酸激酶的补救作用,TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。,T,tk,次黄嘌呤的补救作用,细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。, HAT培养基：,Tk- 细胞株。,TK基因。, 宿主细胞, 载体标记,（2）TK选择过程,含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）,只有转入TK基因的细胞才能生存。,20,真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。,2. 二氢叶

21、酸还原酶基因（DHFR）,（1） 选择原理,二氢叶酸还原酶的必要性,dUMP,dATP,TTP,dCTP,四氢叶酸,四氢叶酸,DHFR+细胞,二氢叶酸,四氢叶酸,二氢叶酸还原酶,二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸,DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。,能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存,不需要补救！,DHFR- 细胞,DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。,需要补救！,不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。, 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救,dUMP,dATP,TTP,dATP,次黄嘌呤,补救,胸苷,补救,无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时，,胸腺嘧啶和

22、次黄嘌呤分别补救:,DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。, 宿主细胞,（2）选择过程,透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。, 无核苷酸的培养基,需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！, 氨甲喋呤“加压”,添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用，可提高选择。,DHFR+基因。, 载体标记,只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。,DHFR-,DHFR-,DHFR+,DHFR+,live,die,无核苷酸的培养基,是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物。,3. 新霉素抗性基因（neor）,（1）选择原理, 新霉素（neomycin）,新霉素的类

23、似物，是一种 氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性。, G418（geneticin）, 新霉素抗性基因-neor,细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。,G418,真核细胞,死亡,G418,存活,neor,真核细胞,含致死剂量G418的完全培养基。, G418培养基,真核细胞株均可。,neor基因。,宿主细胞,载体标记,（2）选择过程,G418：（100-800g/mL）,CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。,氯霉素,cat,含氯霉素的完全培养基。,真核细胞株均可。,cat基因。,乙酰氯霉素,4. 氯霉素乙酰转移酶（CA

24、T）,（1）选择原理,（2） 选择条件,（3） 宿主细胞,（4）载体标记,chloramphenicol acetyl transferase,在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。,（5） CAT分析方法, 免疫学检查：,用抗CAT的血清进行Western blot或ELISA，检查CAT的表达。,Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemic

25、als and Molecular Probes., 分析乙酰氯霉素,二、植物转化体报道基因筛选法,（1）大肠杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。,1. 报道基因（reporter gene),（4）其它,2. 几种报道基因的作用原理,4-甲-D-葡糖醛酸,荧光产物,GUS,GFP,紫外光照,发绿色荧光,5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡糖醛酸,蓝色水解产物,GUS,Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP,转入萤火虫的luciferase的烟草,烟草叶片表达B型肝炎抗原,植物细胞中适用的报道基因,