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1、酶循环法及其在酶法分析中的应用杨昌国，许叶（宁波市医学科学研究所，浙江宁波315010）关键词：酶法分析；酶循环法中图分类号：R461.1 文献标识码：A由于酶法测定的特异性好，检测简便，反应温和，无污染，且灵敏度较高(10100umol/L)，已能满足体液中大部分物质的测定，因此在临床化学测定中已广为应用。随着临床化学的发展，体液中某些微量物质的准确测定逐渐显得重要。酶循环法是利用酶的底物特异性来放大靶物质（被测物）的测定方法。此法仅循环靶物质，减少了样品中存在的其它物质对测定的干扰，因此不需要对样品进行预处理或队靶物质的提取，而且该法不需要专门的设备，是一种前景广阔的测定技术。日本旭化成（
2、Asahi Chemical）公司发展了这一技术，笔者参考旭化成公司的有关资料，将这一技术介绍给国内的同行。1 酶循环法的原理物质A在酶a和底物a(Sa)的存在下转化为物质B，同时生成产物a(Pa)；这物质B又在酶b(Eb)和底物b(Sb)的存在下转化为物质A，同时生成产物b(Pb)。上述反应每循环一次，将消耗与物质A等量的Sa和Sb，同时生成等当量的Pa和Pb。因此在一定时间内，循环反应的次数亦就是Sa和Sb消耗或Pa和Pb生成相当于物质A(或物质B)的倍数，通过检测Sa或Sb的减少或Pa或Pb的生成就可以提供检测物质A(或物质B)的n倍灵敏度。见图1。 底物a(Sa) 产物a(Pa) Ka
3、循环Kb 酶a(Ea) 物质A 物质B 酶b(Eb)产物b(Pb) 底物b(Sb)图1 酶循环法原理1.1 条件1.1.1 物质A和B的浓度与酶a和酶b对底物Sa和Sb的Km值相比较，应相当小，即A或BKmSa(或KmSa)。1.1.2 酶a和酶b对底物Sa和Sb的Km值应相当小，对底物应有高亲和力。1.2 原理 米氏方程 vVS/( S+Km)，vKS，(KV/Km)。当t0、A=A0、B=0时，AB A0；当t0并假设反应已达到平衡状态，那么，Ea的速度是VbKbA。Eb的速度是VbKbB。在平衡状态时，vavb因此，A:B=Kb:Ka。循环反应速度vcvavb(固定的)，假设vcKcA0
4、(Kc=循环速率常数)，那么从KcKaKb/(Ka+Kb)推导，如果Ka+Kb常数，当KaKb时，Kc是最大的。1.3 测定灵敏度 。2 酶循环反应的灵敏度可通过产物的循环常数(Kc)和反应时间(t)来确定；Kc又可通过两种酶的量来确定；酶量又取决于酶的特异活性和Km值，循环反应是在相同的条件(如温度、离子强度等)下进行，两种酶的反应常数亦相同(由于Va/Kma=Vb/Kmb，因此KcKaKb)。既然循环反应的灵敏度可通过Kct(min)来确定，故可用调整加入酶量或反应时间来随意控制。选择Km小的酶，用较小的酶就能得到较高的灵敏度。3 循环反应的类型按反应中使用的酶可分四种类型：3.1 方法A
5、 底物循环，氧化酶和脱氢酶系统。氧化酶对靶物质氧化，脱氢酶又把氧化态的靶物质转化成还原态。靶物质和它的氧化产物作为底物被循环，速率可达50300次/分。举例：溶血卵磷脂(lysolrcithin)(又称溶血磷脂酰胆碱，lysophosphatidyl choline)，是磷脂的一种，它随氧化型LDL和VLDL水平增高而增高，后两者已确认与动脉粥样硬化的发生和发展有关。测定原理见图2。预处理反应：测定反应：(1) (2) DAOS4-AAP(3)DAOS （比色测定） O2 H2O2 醌亚胺 循环 GPO G3P DHAP G3PDH NAD NADH 12-HSD 胆碱 酮类胆酸GO：甘油氧化
6、酶 LYPL：溶血磷脂酶GPC：甘油磷脂酰胆碱 GPCP：磷酸二酯酶G3P：3磷酸甘油 GPO：甘油磷酸氧化酶DHAP：磷酸二羟丙酮 G3PDH：3磷酸甘油脱氢酶12-HSD：12-羟类固醇脱氢酶 DAOS：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧苯胺图2 溶血卵磷脂酶循环法原理3.2 方法B 底物循环，脱氢酶和辅酶系统。靶物质和它的氧化产物作为底物被循环，仅用一种酶和两种辅酶(巯基NAD和NADH)。在410nm测定巯基NADH的增高速率，循环速率约100次/分。举例：胆汁酸测定，原理见图3。 巯基-NAD 巯基-NADH(415nm测定) 循环 3-HSD 胆汁酸 酮类胆汁酸
7、 3-HSD NAD NADH 3-HSD：3-羟类固醇脱氢酶 图3 胆汁酸酶循环法测定原理3.3 方法C 辅酶循环，双脱氢酶系统。靶物质被转化为辅酶(NAD)，使用两种脱氢酶使NAD-NADH间循环。本系统灵敏度很高，循环速率至少可达1000次/分。举例：NH3测定，原理见图4。 NH3 三磷酸腺苷脱氨-NAD 单磷酸腺苷PPi D-葡萄糖 NAD 甲月簪染料(比色测定) 葡萄糖 脱氢酶 循环 黄递酶 D-葡萄糖酸-内酯 NADH 四唑盐 图4 NH3 酶循环法测定原理利用这一反应原理，增加前反应亦可测定尿素和肌酐。尿素前反应：肌酐前反应：3.4 方法D 氨循环，NAD合成酶-脱氢酶系统。靶
8、物质NH3被转化成NAD，再通过亮氨酸脱氢酶使L-亮氨酸转变成氧化异己酸和NH4+，NH4+又重复反应，原理见图5。 ATP AMP+PPi NAD合成酶 NH4+脱氨-NAD NAD+ Mg2+ 亮氨酸 亮氨酸脱氢酶 NH4+氧化异乙酸 NADH4 酶循环法的特征和应用前景传统的酶反应只能按靶物质的量生成相应的产物量，而酶循环法则可在一定的反应时间内通过靶物质的重复反应来增加产物的量。因此，可通过延长反应时间和/或增加酶的用量来加速循环以增加循环次数(循环速率)来提高灵敏度。选择用高循环速率的酶和合适的循环方法可使循环速率达到501000次/分。另外通过使用酶的特殊底物(如巯基-NAD)可简
9、化反应体系，亦可偶联呈色反应(如四氮唑染料或Trinder反应)使其成为可见光谱测定。本法还可与荧光和发光分析结合使灵敏度更高。由于本法是一个比色测定，它可能被用作EIA检测方法，消除测定污染的存在。5 酶循环法推广应用尚需克服的难题 由于酶循环法具有诸多优越性，是一种有前途的测定方法，但目前要推广使用尚有一些问题需要解决：因此法工具酶的用量是普通酶法的10到数10倍，费用较高。酶的特殊底物硫代-NAD的价格亦很高。体液某些微量物质的测定尚缺乏工具酶。因此酶循环法的推广应用还有待工具酶和有关原材料的大幅度降价，以及新工具酶的开发。尽管如此，这一技术已为临床化学分析开辟了新天地，为体液中微量物质的准确测定提出了美好的前景。4文书+