高春生化药物常用分析方法.ppt

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1、生化药物常用分析方法,1.生化药物概念 2.生化药物的分类 3.蛋白质的含量测定 4.电泳法 5. 酶的测定,1生化药物的概念,生化药物是运用生物化学的研究成果，把生物体产生的各种基本物质用于预防、诊断和治疗疾病的一大类药物。包括从动物、植物、微生物等生物体中提取分离的天然物质及部分化学合成产物。通常所说的生化药物是专指在生物体内起重要生理作用的生命基本物质。如：氨基酸、多肽、蛋白质、核酸及其降解物、酶与辅酶、维生素、激素、糖与脂类等一大类药物。,2. 生化药物的分类,(1) 按其来源分：生化药物按其来源不同可分为植物生化药物、动物生化药物、微生物生化药物及合成生化药物。 (2) 按其化学性质

2、及作用分：可分为氨基酸、多肽、蛋白质、核酸及其降解物、酶与辅酶、激素、维生素、糖、脂、有机酸等。,3. 蛋白质的含量测定,3.1 氨基酸及蛋白质的显色反应 3.2 凯氏定氮法 3.3 福林-酚试剂法 3.4 双缩脲法 3.5 紫外吸收法,3.1氨基酸及蛋白质的显色反应 3.1.1 茚三酮反应 3.1.2 双缩脲反应 3.1.3 与酚试剂的反应,3.1.1 茚三酮反应：蛋白质在pH57之间，与茚三酮丙酮溶液加热煮沸时即出现蓝紫色。此反应用于蛋白质的定性与定量。此反应的灵敏度为1g。凡具有氨基、能放出氨的化和物几乎都有此反应，故可用于多肽与蛋白质及氨基酸的定性与定量分析。,3.1.2 双缩脲反应

3、： 蛋白质溶液加入氢氧化钠溶液后，逐滴加入0.5%硫酸铜溶液，则出现紫色或紫红色。 原理 当脲（尿素）加热（约180），两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲，然后在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物。蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。肽键越多反应颜色越深。氨基酸无此反应。,3.1.3 与酚试剂的反应：蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸 能与含有磷钨酸磷鉬酸化合物的酚试剂起反应。在碱性条件下后者被还原成蓝色物质。颜色的深浅与蛋白质的量成正比，所以可作为蛋白质的比色测定方法。,3.2凯氏定氮法 3.2.1 原理 3.2.2 试剂和仪器 3.2.

4、3 操作步骤 3.2.4 注意事项,3.2凯氏定氮法 3.2.1 原理 每一种蛋白质都有其恒定的含氮量一般为1517.6%，平均为16，因此只要测得样品中的含氮量，就可以通过计算求得样品的蛋白质含量。 定氮法的基本原理是将蛋白质用浓硫酸分解，并使其中的氮变成铵盐状态，再与浓碱作用，放出的氨被酸吸收，滴定剩余的酸，计算出含氮量。微量凯氏定氮法最低可测出0.05毫克氮，相当于0.3毫克左右蛋白质。 蛋白质含量蛋白质含氮量100/16 蛋白质含氮量6.25,3.2.2. 试剂和仪器 1微量定氮仪器装置全套：包括蒸汽发生器、冷凝蒸汽收集器、微量定氮蒸馏瓶、小型冷凝管。 2消化炉（电炉） 3浓硫酸 4.

5、 氢氧化钠溶液（40%） 5消化剂：硫酸铜及硫酸钾按1:4（w/w）至1：5比例，研细充分混匀。 6标准0.010N盐酸和0.010N氢氧化钠溶液。 7指示剂0.1%甲基红乙醇溶液。 82硼酸吸收液,3.2.3 凯氏定氮法一般步骤,消化,蒸馏,滴定,返回,3.2.4.注意事项 1必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。 2消化初期瓶内物质碳化变黑，并产生泡沫，要特别注意控制火力，微火加热，不能让黑色物质上升到颈部，否则将严重影响样品的测定结果。当混合液停止冒泡，气体逸出也较均匀时，可适当加大火焰，使瓶内液体微沸而不致跳荡。硫酸溶液逐步从棕黑色变成澄清。由于消化液澄清并不说明消化一定完成

6、，为保证反应充分完成，继续沸腾1小时。反应终了，溶液应呈淡蓝色或无色透明，若带有黄色表示消化末完全。如果蛋白质样品中含赖氨酸或组氨酸较多，则消化时间要延长1-2倍。,3消化完毕，静置使冷，仔细加入少量蒸馏水，洗涤管壁。因实验室中空气往往含有极微量的氨，每次分析时都要另做空白对照，即一切处理与样品管相同，但不加蛋白质样品。 4蒸馏前要先蒸洗15分钟以上。 5小心加样，避免样品污染凯氏瓶口部和颈部。,6使用凯氏定氮仪时，开关甲、乙的掌握与实验成败很有关系，在加样时，开关甲一定要开启着，而且一定要使蒸汽发生后才能关闭，否则会发生样品倒吸现象。开关乙也要关闭及时，防止氨逸出。 7蒸馏时，保持火力稳定，

7、否则易发生倒吸现象。,8氨气蒸馏时，为了使所有硫酸铵分解为氨，必须加入足量40%氢氧化钠，加入时要水平缓慢，以免产生剧烈反应而导致瓶内酸液倒吸和氨的损失，碱加入后，有铜氨离子、氢氧化铜或氧化铜等化合物生成，溶液呈蓝色或褐色。并有胶状沉淀产生，这是正常现象，反之，如果不变，说明碱液可能不够。,9如果测定的不是纯蛋白质，可能含有非蛋白氮，必须分别测定蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮的测定可以将样品制成均浆或抽提液，用三氯醋酸或钨酸等沉淀剂将蛋白质沉淀出来，按总氮法测定上清液的含氮量，便得到非蛋白质氮。,3.3 福林-酚试剂法 3.3.1 原理 3.3.2 试剂 3.3.3 操作步骤 3.3.4 注意事项

8、,3.3 福林-酚试剂法 3.3.1.原理： 福林-酚试剂法是测定蛋白质浓度应用最广泛的一种方法。 福林-酚试剂（Folin-phenol reagent）的显色原理包括两步反应：第一步是在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物；第二步是蛋白质铜复合物还原磷鉬酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。,本法的优点是操作简便，灵敏度高。缺点是有蛋白质特异性的影响，即不同蛋白质的显色强度稍有不同；标准曲线也不是严格的直线形式。 本法的可测定范围是每毫升25-250微克蛋白质。,3.3.2.试剂 试剂A：（1）4碳酸钠溶液；（2）0.2mol/L氢氧化钠溶液；（3）

9、1硫酸铜溶液（4）2酒石酸钾钠溶液（或其钾盐或钠盐）。临用前将（1）与（2）等体积混合，（3）与（4）等体积混合，然后这两种试剂按50：1的比例混合，即成福林酚试剂A。,试剂B：在1.5升容积的磨口流瓶中加入100克钨酸钠，25克钼酸钠及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸充分混和，接上回流冷凝管小火流10小时。回流结束后，加入150克硫酸锂，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟以便驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色，（如仍呈绿色，左须再重复滴加液体溴 的步骤）稀至1升，过滤，过滤置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准氢氧化钠滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释（约加水

10、1倍）使最终的酸浓度为1mol/L。,3.3.3 操作步骤 （1）1ml待测样品溶液（适当稀至约含25-250微克蛋白质），加5ml试剂A混合，室温下放置10分钟后加0.5ml试剂B，立即混和均匀，30分钟后，以不含蛋白质试剂空白对照比色。可选用波长650nm或660nm。,（2）标准曲线制备： 在各试管中分别加牛血清白蛋白溶液（250微克/毫升）0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0毫升，并分别加蒸馏水补充到1毫升（即各管中分别含蛋白质量0、50、100、150、200和250微克）。以后加试剂及比色等操作步骤与样品操作相同。,3.3.4.注意事项 (1)牛血清白蛋白的含量明确。 (2)

11、福林酚试剂B在酸性条件下比较稳定，而福林酚试剂A在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜蛋白质溶液。所以加入福林酚试剂B这一步混和速度要快，使还原反应产生在磷鉬酸磷钨酸试剂被破坏之前，否则会使显色程度减弱 。 (3)反应时间及反应温度严格控制。 (4)按照化学实验的要求精密操作。,3.4 双缩脲法 3.4.1 原理 3.4.2 试剂 3.4.3 操作步骤 3.4.4 注意事项,3.4.双缩脲法 3.4.1原理 双缩脲（NH2CONHCONH2）是两分子脲经180左右加热，放出一分子氨后所得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或

12、通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。,双缩脲法是测定蛋白质浓度常用方法之一，它除了操作简便、迅速外，最大的优点是受蛋白质的特异性影响较小，但灵敏度差，所需样品量大。利用铜复合物有紫外吸收的特性，使双缩脲方法能在数十微克水平进行测定。,3.4.2试剂 碱性铜试剂 0.175克硫酸铜溶解于约15毫升水中，置于一100毫升容量瓶中，加入30毫升浓氨水，30毫升冷的蒸馏水及20毫升饱和氢氧化钠溶液，混匀后，放置至使溶液温度与室温相同，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀。此试剂在室温下可以放置3-4个月不影响显色。,3.4.3操作步骤 (1)标准曲线制备 每组取7支试管，依次加入蛋白质标准溶液

13、0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分别补足蒸馏水至3毫升，混匀后各管加2毫升碱性铜试剂，充分混和后，呈现紫色，立即于540nm下测定光吸收（以第一管作空白对照）。 (2)供试品测定 取3毫升样品溶液，加入碱性铜试剂2毫升，充分混匀后，于540nm下测定吸收值，操作条件同标准曲线。,3.4.4.注意事项 样品溶液与试剂混合后，有时约30分钟后有雾状沉淀 产生。这种现象对含脂肪类物质的蛋白质抽提液较易发生，而对于纯蛋白质溶液不明显。克服的方法有三种：（1）加入试剂后立即比色，至少应在30分钟内完成；（2）如沉淀已经产生，则可以放置二小时或更多时间，离心去沉淀后取上清液比色；（

14、3）加1.5毫升乙醇或石油醚，离心后比色。,3.5 紫外吸收法 原理 蛋白质分子中所含有的酪氨酸和色氨酸残基使蛋白质在280nm下具有最大吸收值；蛋白质溶液在238nm下的光吸收值，其吸收强度与肽键量成正比。利用在一定波长范围内吸收值与蛋白质浓度成正比关系可以进行蛋白质含量的测定。,4.电泳分析法 4.1 电泳的基本概念 4.2 电泳的分类 4.3 醋酸纤维膜电泳法 4.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,4.1 电泳的基本概念 电泳：带电颗粒在电场作用下向着与其电 性相反的电极移动，称为电泳。,4.2. 电泳的分类 按分离原理分类可分为区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳4种。 （1） 区带电

15、泳 电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。 （2） 移界电泳 是在U形管中进行的，由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。,（3 ） 等速电泳 需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各区带相随分成清晰的界面，并以等速移动。 （4 ）等电聚焦电泳 由于具有不同等电点的两性电解质载体在电场中，自动形成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点的pH处聚集成很窄的区带，且分辨率较高。从表面上看与区带电泳相似，但原理不同。,4.3.醋酸纤维膜电泳法 4.3.1 基本概念 什么是醋酸纤维膜电泳 以醋酸纤维膜为支持介质的一种区带电泳技术。 4.3.2 原理 蛋

16、白质是两性物质，具有两性游离特性。人血白蛋白为一种蛋白质，因而其具有两性化合物的性质，在碱性缓冲液中，即pH质大于等电点时，蛋白质分子带负电荷，在电场中向正极迁移，如果人血白蛋白中含有其他杂蛋白，其带电荷的量会不同于人血白蛋白，在电场中迁移的速度就不同，带负电荷越多的蛋白质其迁移速度越快。这样就会在醋酸纤维薄膜留下不同的区带，经染色后，脱色，扫描后，即可测得人血白蛋白的纯度。,4.3.3 特点：微量，快速，简便，分辨力高，对样品无拖尾及吸附现象等。目前，国内有醋酸纤维薄膜商品出售，不同厂家生产的醋酸纤维薄膜主要在乙酰化、厚度、孔径、网状结构等方面有所不同，但分离效果基本一致，一般多采用浙江黄岩

17、化工厂生产的醋酸纤维薄膜。,4.3.4 酸纤维薄膜与滤纸比较 酸纤维薄膜与滤纸比较有以下优点 （1） 酸纤维薄膜对蛋白质样品吸收极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量的精确性。 （2） 快速省时, 由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较小，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45-60分钟即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90分钟左右。,（3） 灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2l血清，甚至加样体积少至0.1l，临床医学检验利用这一特点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。 （

18、4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如，胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 （5） 醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰醋酸，乙醇混合或其他溶液浸泡后制成干板，有利于扫描定量及长期保存。,由于醋酸纤维薄膜电泳操作简单，快速，价廉。目前已广泛用于分析检测血浆蛋白，脂蛋白，糖蛋白，胎儿甲种球蛋白，体液，脊髓液，脱氢酶，多肽，核酸及其他生物大分子，为心血管疾病，肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。,4.3.5 酸纤维薄膜电泳操作步骤,仪器与薄膜的准备,点样,电泳,染色与漂洗,透明,返回,4.3.6 注意事项 1、醋酸纤维素

19、薄膜的预处理 2、缓冲液的选择 3、加样量 4、电量的选择 5、染色液的选择 6、透明及保存,4.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 4.4.1原理 以纸，醋酸纤维素薄膜，琼脂（糖）及均一聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳，由于各种蛋白质所带的电荷，分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。为消除净电荷对迁移率的影响，可采用聚丙烯酰胺浓度剃度电泳，利用它所形成孔径不同引起的分子筛效应，可将蛋白质分子分开。也可在整个电泳体系中加入十二烷基硫酸钠（SDS），则电泳迁移率主要依赖于分子量，而与所带净电荷和形状无关。这种电泳方法为SDS-PAGE。,4.4.2用SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 SDS是阴离子

20、去污剂，它在水溶液中，以单体和分子团混合物的形式存在，蛋白质在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量的负电荷，当其与蛋白质结合时，所,带的负电荷大大超过了天然蛋白质原由的负电荷，因而消除和掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。测定未知蛋白质分子量时，可选用相应的一组标准蛋白质，同时进行SDS-PAGE，则可根据已知蛋白质的电泳迁移率和分子量的对数作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。,优点 用此法测定蛋白质分子量具有仪器设备简单，操作方便，样品用量少

21、，耗时少（仅需一天），分辨率高，重复效果好等优点，因而得到非常广泛的应用与发展。它不仅用于蛋白质分子量的测定，还可用于蛋白 混合组分的分离和亚组分的分析，当蛋白质经SDS-PAGE分离后，设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDS，还可进行氨基酸顺序，酶解图谱及抗还原性质等方面的研究。,缺点 在蛋白质所带电荷异常或构象异常时，带有较大辅基的蛋白（如糖蛋白）及一些结构蛋白等测出的分子量不太可靠。如组蛋白F1，本身带有大量的正电荷，虽然结合了正常量的SDS，仍不能完全掩盖其原由正电荷，故用SDS-PAGE测得的分子量为35000，而用其他方法测定的分子量为21000。因此要确定某种蛋白质的分子量

22、时，最好用2种测定方法相互验证，则更可靠。尤其是对一些由亚基或2条以上肽链组成的蛋白质，由于,SDS巯基乙醇的作用，肽链间的二硫键被打开，解理成亚基或单个肽链，因此测定结果只是亚基或单条肽链的分子量，还需用其他方法测定其分子量中肽链的数目。,4.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤,安装夹心式垂直板电泳槽,配胶及凝胶板的制备,分离胶和浓缩胶的制备,样品的处理与加样,电泳,返回,4.4.4 注意事项 1. SDS的纯度 2. SDS与蛋白质的结合量 3. 凝胶浓度 4. 对样品的要求 5. 凝胶成像,5.酶的测定,5.1 酶的概念： 5.2 酶的特点： 5.3 酶的专一性： 5.4 酶的分

23、类与命名 5.5 酶的化学组成 5.6 酶促反应的影响因素 5.7 酶活力的测定方法,5.1 酶的概念 酶是生物体内一类具有催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。,5.2 酶的特点 5.2.1 酶作用一般都要求比较温和的条件，如常温，常压，接近中性的酸碱度等。 5.2.2 酶的催化效应非常高酶促反应比相应的非酶促反应要快1031017倍。 5.2.3 酶具有高度的专一性酶对所作用的物质（称为底物）有严格的选择性，,通常一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质，这也说明酶对底物的化学结构有高度严格要求。 5.2.4 酶的催化活性是受到调节和控制的。他的调控方式很多，包括反馈调节

24、、抑制剂调节、共价修饰调节、酶原激活及激素控制等。 5.2.5 酶可催化某些特异的化学反应，体内某些物质的合成只能由酶促反应完成。如某些蛋白质、多肽、核酸以及其他一些生物活性物质的合成都要通过酶促反应进行。,5.3 酶作用的专一性 一种酶只作用于一类化合物或一定的化学键，以促进一定的化学变化，生成一定的产物。受酶催化的化合物称为该酶的底物或作用物。酶对底物的专一性通常分为以下几种。 5.3.1立体化学专一性 是从底物的立体化学性质来考虑的一种专一性。可分为两类（1）立体异构专一性（2）几何异构专一性。,5.3.2非立体异构专一性 如果一种酶不具有立体化学专一性，则可从底物的化学键及组成该键的基

25、团来考虑其专一性。如以A-B为底物，可认为它是由三部分组成，即A、B与连接它们的键。非立体化学专一性可依据酶对这三种组成部分选择程度的不同分为三类（1）键专一性 （2）基团专一性 （3）绝对专一性 。,5.4 酶的分类与命名 5.4.1 酶的分类 依据国际酶学委员会的规定，按催化反应的类型可分为六大类。 （1）氧化还原酶类 催化氧化还原反应。 （2）转移酶类 催化功能基团的转移。 （3）水解酶类 催化水解的反应 （4）裂合酶类 催化水、氨或二氧化碳的去除或加入。 （5）异构酶类 催化各种类型的异构作用。 （6）合成酶类 催化消耗ATP的成键反应,5.5 酶的化学组成 酶和其他蛋白质一样，根据其

26、组成成分可分为简单蛋白酶和结合蛋白酶两种。 单纯酶 酶的活性仅仅决定于它的蛋白质结构，如水解酶类（淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶及尿酶等），这些酶的结构由简单蛋白质构成，故称为单纯酶。,结合酶 其结构中蛋白质分子外，还含有非蛋白质部分，如大多数氧化还原酶类，这些酶由结合蛋白质构成，因而称为结合酶。在结合酶中，蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分统称为辅因子。辅因子又可分成辅酶和辅基两类。酶蛋白与辅因子结合成的完整分子成为全酶，即全酶=酶蛋白+辅因子（辅酶或辅基）。只有全酶才有催化活性，将酶蛋白与辅因子分开后均无催化作用。,根据蛋白的特点和分子大小又把酶分成三类 （1） 单体酶 只有一条多肽链

27、（2） 寡聚酶 由几条至几十条多肽链亚基组成。 （3） 多酶体系 是由几种酶彼此嵌合形成的复合体。他有利于一系列反应的连续进行。,5.6 酶促反应的影响因素 5.6.1 底物浓度对酶反应速度的影响 5.6.2 pH的影响与最适pH 5.6.3 温度的影响与最适温度 5.6.4 酶浓度的影响 5.6.5 激活剂的影响 5.6.6 抑制剂的影响 5.6.7 酶活力的测定方法,5.6.1 底物浓度对酶反应速度的影响 酶促反应中，酶先与底物形成中间复合物，再转变成产物，并重新释放出游离的酶。在酶浓度恒定的条件下，当底物浓度很小时，酶未被底物饱和，这时反应速度取决于底物的浓度，底物浓度越大，单位时间内E

28、S生成的越多，而反应速度取决于ES的浓度，故反应速度也随之增高。当底物浓度加大后，酶逐渐被底物所饱和，反应速度的增加和底物的浓度就不成正比，续而底物增加至极大值，所有酶分子均被底物饱和，所有的E均转变成ES，此时的反应速度不会进一步增高。,5.6.2 pH的影响与最适pH 大多数酶的活性受pH影响较大。在一定pH下酶表现最大活力，高于或低于此pH，活力均降低。酶表现最大活力时的pH称为酶的最适pH。PH对酶反应速度的影响，主要有下列原因 （1） 影响酶和底物的解离 酶的活性基团的解离受pH的影响，有的酶必须处于解离状态方能很好的与底物结合，在这种情况下，酶和底物解离最大的pH有利于酶促反应的加

29、速。 (2） 影响酶分子的构象 过高过低的pH会改变酶的活性中心的构象，甚至会改变整个酶分子的结构使其变性。,5.6.3 温度的影响与最适温度 化学反应速度随温度的增高而加快，但酶是蛋白质，可随温度的升高而变性。 5.6.4 酶浓度的影响 在一定条件下，酶的浓度与反应初速度成正比。因为酶催化反应时，酶先要与底物形成中间物，当底物浓度大大超过酶浓度时，反应达到最大速度，这时增加酶浓度可增加反应速度，反应速度与酶浓度成正比关系。这也是酶活力测定常用的方法。,5.7 酶活力的测定方法 酶的定量一般指测定酶的活力，由于酶不易提纯，一些酶制剂中常含有很多杂质，所以酶含量不能象化学药品用重量表示，而是用单

30、位时间内催化某一特定反应的能力，即酶促反应速度大小，间接测得酶活力。一般用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。在实际测定过程中底物均过量，少量底物的减少难以准确测定，而产物从无到有，测定起来比较容易，所以中国药典上收载的品种大部分采用测定产物的方法。 酶活力的测定的三要素:温度;pH;时间,5.8 酶活力测定举例 胰蛋白酶的效价测定 5.8.1 原理：胰蛋白酶可以催化酪蛋白水解产生不被三氯醋酸所沉淀的肽及氨基酸、色氨酸和苯丙氨酸，在275nm处有较强的吸收，以酪氨酸为对照品进行定量测定，即：每分钟水解酪蛋白产生成三氯醋酸不沉淀物（肽及氨基酸）275nm波长处与1umol酪氨酸相当的酶量

31、，为1个活力单位。 试液：,5.8.2 操作步骤 1 对照品溶液的制备： 2 供试品原液的制备： 3 供试品溶液的制备： 4 空白溶液的制备： 5 在275nm处测定吸收值。,5.8.3 注意事项： 1. 供试品原液的制备中氯化钙溶液的温度一定要控制在5以下，防止胰蛋白酶的降解。 2研磨一定要快速、均匀。 3. 温度恒定，采用恒温水浴，要求温度恒定在正负0.1以内（对恒温水浴箱的要求较高）。 4时间准确，要求用秒表计时。 5反应过程中及反应完成，在全程中要严格控制溶液的pH，不得任意增加底物溶液、终止剂的量，避免改变溶液的pH，因为底物溶液和终止剂，已经是过量的。三氯醋酸易吸湿，但不要因此而多

32、称三氯醋酸的固体，提高其浓度，否则会造成测定结果偏低。,小结,1.生化药物概念 2.生化药物的分类 3.蛋白质的含量测定 4.电泳法 5. 酶的测定,前3节简单介绍了有关生化药物的常识，什么是生化药物，生化药物的分类等。 重点介绍了蛋白质的含量测定方法。 主要有：（1）凯氏定氮法：应用每一种蛋白质都有其恒定的含氮量一般为1517.6%，平均为16，只要测得样品中的含氮量，就可以通过计算求得样品的蛋白质含量。,（2）福林-酚试剂法：也是测定蛋白质浓度应用最广泛的一种方法。福林-酚试剂（Folin-phenol reagent）的显色原理包括两步反应：第一步是在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜

33、复合物；第二步是蛋白质铜复合物还原磷鉬酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便，灵敏度高。缺点本方法只与蛋白质中个别的氨基酸反应而受蛋白质中氨基酸组成的特异影响，即不同蛋白质所含酪氨酸和色氨酸量的不同而显色强度有所差异，这就要求作为标准的蛋白质其显色氨基酸的量应与样品接近，减少误差。,（3）双缩脲法：双缩脲（NH2CONHCONH2）是两分子脲经180左右加热，放出一分子氨后所得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色，凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。双缩脲法是测定蛋

34、白质浓度常用方法之一，它除了操作简便、迅速外，最大的优点是受蛋白质的特异性影响较小，但灵敏度差，所需样品量大。利用铜复合物有紫外吸收的特性，使双缩脲方法能在数十微克水平进行测定。,（4）紫外吸收法：蛋白质溶液在238nm下的光吸收值，其吸收强度与肽键量成正比。利用该关系可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法操作简便，快速，所需样品量少。此法的缺点是对于测定物与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，也会干扰测定。,第4节主要介绍了电泳分析方法的有关知识，电泳的基本原理，是带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动。用蛋白质的纯度

35、测定及分子量测定具体介绍了醋酸纤维素薄膜电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。醋酸纤维素薄膜电泳是通过电泳缓冲液的酸碱度使蛋白质分子解离成带不同电荷的分子，在电场的作用下形成了不同的区带，从而将蛋白质进行分离。分开。,SDS-PAGE电泳是蛋白质在巯基乙醇的作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量的负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原由的负电荷，因而消除和掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。,SDS-PAGE电泳是蛋白质在巯基乙醇的作用下，还原成单链，

36、再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量的负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原由的负电荷，因而消除和掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。,SDS-PAGE电泳是蛋白质在巯基乙醇的作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量的负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原由的负电荷，因而消除和掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。,第5节主要介绍了酶的有关知识 5.1 酶的概念 5.2 酶的特点 5.3 酶的专一性 5.4 酶的分类与命名 5.5 酶的化学组成 5.6 酶促反应的影响因素 5.7 酶活力的测定方法,谢谢,