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1、2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 酶标酶标仪常见技术和应用仪常见技术和应用 尹迪 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molec
2、ular Devices, LLC or their respective owners. 酶标仪工作原理及应用范围 光吸收检测技术原理及常见应用 荧光检测技术原理、分类及常见应用 化学分光技术检测原理及常见应用 Alpha技术特点 Agenda 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 工作原理工作原理为为一台一台升
3、级版升级版的的分光光度计分光光度计 酶酶标标仪工作原理仪工作原理 不同物质对不同物质对 特点波长光特点波长光 吸收值吸收值 1.紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 2.可见分光光度计可见分光光度计 3.紫外紫外分光光度计分光光度计 4.荧光分光光度计荧光分光光度计 5.近红外分光光度计近红外分光光度计 6.红外分光光度计红外分光光度计 7.双光束紫外可见分光光度计双光束紫外可见分光光度计 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are prope
4、rty of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 酶酶标仪标仪与分光光度计与分光光度计的的不同不同？ 1:通量通量上上 支持6、12、24、48、96、384孔板，高端酶标仪 可达到3456孔板 2:功能功能上上 单功能酶标仪（吸收光、荧光、化学发光） 多功能酶标仪 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC
5、or their respective owners. 酶标仪酶标仪多功能微孔板读板机（仪）多功能微孔板读板机（仪） 学名：微孔读板机（仪） Microplate Reader 俗称：国内俗称酶标仪，因早期主要用于酶联免疫检 测（ELISA），故久之习称为酶标仪 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 酶标仪能做什么
6、？酶标仪能做什么？ 凡是与凡是与光信号相关光信号相关的的实验、实验、需要高通量、需要节省试需要高通量、需要节省试 剂的实验剂的实验 且且可以转移可以转移到到微孔微孔板板中液体物质中液体物质 都都可以考虑使可以考虑使用微孔板检测仪（酶用微孔板检测仪（酶标标仪）进仪）进行信号检行信号检 测！测！ 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective
7、owners. 目前中国市场主要几个酶标仪厂家目前中国市场主要几个酶标仪厂家 产品产品线丰富（高中低，线丰富（高中低，Multi-mode 11、Single-mode 9） 新产品推出速度快（新产品推出速度快（Paradigm、I3+ MinMax 、I3+ Scanlater） 品牌知名度高、市场占有率大品牌知名度高、市场占有率大 MD主要竞争对手（主要竞争对手（Multi-mode 8、Single-mode 10） 新产品推出紧随新产品推出紧随MD（如（如Cytation3对应对应I3、Neo对应对应 Paradigm ） 产地瑞士、在欧洲及北美有较高知名度产地瑞士、在欧洲及北美有较高
8、知名度 （Multi-mode 3、Single-mode 3） 最近无新产品推出，进入中国较早，在东北地区用户较多最近无新产品推出，进入中国较早，在东北地区用户较多 主要产品非酶标仪（主要产品非酶标仪（Multi-mode 3、Single-mode 10） 最近无心产品推出最近无心产品推出 具有专利具有专利Alpha技术，但没有型号支持技术，但没有型号支持HTRF技术（认证）技术（认证） 主要产品非酶标仪（主要产品非酶标仪（Multi-mode 4、Single-mode 2） 多功能酶标仪（覆盖全波长）仅一款多功能酶标仪（覆盖全波长）仅一款VF，只有四功能，只有四功能 无最新产品问世无最
9、新产品问世 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 光吸收检测技术原理光吸收检测技术原理 透射透射率率和和吸光度吸光度 I0 = Ia + It + Ir 入射光强度为 I0，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir 因为反射光强度Ir由微孔板材料决定 I0 = Ia + It 朗伯比尔定律 K摩尔吸光系
10、数、a吸光系数,根据C单位决定 透射率透射率 吸收值吸收值 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 光波长范围光波长范围 多数低端单功能酶标仪光谱范围（400-750nm） 中、高端单功能或多功能光谱范围（200-1000nm） 2012 For research use only. Not for use in d
11、iagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. Comparison of Microplate Readers with Absorbance Detection 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devi
12、ces, LLC or their respective owners. 物质最佳吸收物质最佳吸收波长波长 不同物质有不同吸收峰，有些实验检测物质需要更宽的波长 范围 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 光吸收的基本检测类型光吸收的基本检测类型 特定波长检测特定波长检测: DNA、RNA及蛋白质浓度 比色测定比色
13、测定: 检测反应的产物产生的颜色变化（450nm） 酶联免疫吸附试验（ELISA） 浊度检测浊度检测: 检测样品中微颗粒产生的光的散射 细菌的生长（600nm） 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 光吸收检测常见应用光吸收检测常见应用 利用光吸收原理最常见的几种生物学实验 DNA/RNA含量检测 常用于快速检测质
14、粒DNA浓度 ELISA（酶联免疫吸附试验）检测 方法多（间接法、竞争法、双抗夹心法等）、应用广 细胞活力检测 MTT、XTT等 酶活动力学检测 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. DNA、RNA或蛋白浓度检测或蛋白浓度检测 DNA双螺旋中双螺旋中碱基碱基 蛋白质蛋白质酪氨酸酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸成分含量色氨酸
15、、苯丙氨酸成分含量 A = a*c*l a = 物质消光系数物质消光系数 c = 浓度浓度 l= 光光径（径（0.5mm或者或者1mm） SMP软件自动给出软件自动给出 DNA浓度：浓度：OD260=1表示表示 50 g/ml双链双链DNA(dsDNA) DNA纯度：纯度：纯度计算纯度计算(OD260/OD280) DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8 决定上决定上 样体积样体积 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are pr
16、operty of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 加入底物加入底物 显色反应显色反应 阳性样品阳性样品 阴性样品阴性样品 反应原理反应原理 最最常见应用类型常见应用类型- ELISA（酶联免疫吸附试验）实验（酶联免疫吸附试验）实验 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respec
17、tive owners. 酶决定底物类型酶决定底物类型 碱性磷酸酶（AP） 常用底物：PNPP 405nm 特点：本底低，灵敏度高，较昂贵 辣根过氧化物酶(HRP) 底物：ABTS 410/650nm OPD 492nm TMB 450nm 特点：常用，灵敏度不如AP系统 全波长带来优势全波长带来优势ELISA不同颜色需不同波长不同颜色需不同波长 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devic
18、es, LLC or their respective owners. 细胞活力检测细胞活力检测 MTT-黄色染料 被活体细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原 形成蓝紫色结晶形成蓝紫色结晶-甲瓒甲瓒 DMSO溶解溶解 检测检测OD570(OD630作为背景参照）作为背景参照） cell 细胞质细胞质 细胞核细胞核 线粒体线粒体 细胞活性检测细胞活性检测 MTT、XTT法法 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molec
19、ular Devices, LLC or their respective owners. 酶活力分析酶活力分析 酶活性酶活性分析：分析：就是指在一定条件下，通过连续就是指在一定条件下，通过连续 测定酶测定酶的吸光值，的吸光值，从而从而达到动态监测酶活性的达到动态监测酶活性的 一个过程。一个过程。 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（ LDH ）活）活 性检测性检测 -半乳糖苷酶检测半乳糖苷酶检测 血清心肌酶活性检测血清心肌酶活性检测 脱氢酶活性检测脱氢酶活性检测 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Tradem
20、arks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 光吸收法优缺点光吸收法优缺点 优点：优点： 灵敏、特异、简单、快速、对环境没有污染、稳定及 易于自动化操作等 不足：不足： 降低灵敏度（针对新方法其易受到杂质干扰)、动态范 围比较窄（3数量级）、步骤繁琐(清洗步骤多) 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are pro
21、perty of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 我们熟悉的荧光现象我们熟悉的荧光现象 荧光显微镜观察标记荧光染料分子的细胞 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光检测技术特点和原理荧光检测技术特点和原理 荧光荧光检测特点检测特点 应用领域广
22、泛、可多标记检测、灵敏度高应用领域广泛、可多标记检测、灵敏度高 荧光检测原理荧光检测原理 Light light detector 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光技术分类荧光技术分类 荧光强度荧光强度 FI 荧光共振能量转移荧光共振能量转移 FRET 时间分辨荧光时间分辨荧光 TRF 时间分辨荧光共振能
23、量转移时间分辨荧光共振能量转移 TR-FRET 荧光偏振荧光偏振 FP 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 酶标酶标仪如何进行荧光强度检测仪如何进行荧光强度检测M系列为例系列为例 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. T
24、rademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 斯斯托克位移（托克位移（Stokes shift） 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光染料分子具有不同斯托克位移荧光染料
25、分子具有不同斯托克位移 Fluorescein Coumarin Resorufin Cascade yellow dye Stokes shifts的范围从的范围从20nm到超过到超过150nm不等不等 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光强度检测常见应用荧光强度检测常见应用 生物大分子定量（生物大分子定量
26、（DNA/RNADNA/RNA或或蛋白质）蛋白质） 免疫荧光免疫荧光（荧光标记（荧光标记物，如物，如GFPGFP、YFPYFP、CFPCFP等）等） 细胞学细胞学分析（细胞增殖分析（细胞增殖/ /细胞毒理细胞毒理/ /细胞迁移细胞迁移/ /细胞细胞 吸附吸附/ /细胞渗透）细胞渗透） 线粒体膜电位分析线粒体膜电位分析 钙钙流检测流检测 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LL
27、C or their respective owners. 饱和荧光染料可以饱和荧光染料可以嵌入嵌入核酸碱基小沟中，使用特定波长的光激发该染料，检测染核酸碱基小沟中，使用特定波长的光激发该染料，检测染 料的发射光，光强度与核酸的浓度在一定范围内成线性关系料的发射光，光强度与核酸的浓度在一定范围内成线性关系 检测原理：检测原理： 荧光法荧光法进行进行DNA定量定量 ds-DNA PicoGreen Ex Em 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein
28、are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光强度检测灵敏度和动态范围上的优势荧光强度检测灵敏度和动态范围上的优势 如DNA含量检测理论可达到300pg级 吸收光法（吸收光法（OD260） 荧光法荧光法 操作方法操作方法 简单，无需标准曲线简单，无需标准曲线 需做标准曲线需做标准曲线 灵敏度灵敏度 低低 高高 纯度要求纯度要求 核酸纯度要求高核酸纯度要求高 核酸纯度要求不高核酸纯度要求不高 RNA定量定量 不稳定不稳定 稳定稳定 干扰因素干扰因素 多多 少少 线性范围线性范围 窄窄(3 Log) 宽宽(
29、6 Log) 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. MultiTox-Flour细胞活力检测方法（细胞活力检测方法（Paradigm优势）优势） Paradigm 双光源卡双光源卡 盒盒 细胞毒制剂处理细胞毒制剂处理 加入底物加入底物 同时检测活同时检测活细胞和死细胞的细胞和死细胞的 数量数量 细胞数数据细胞数数据
30、归一化（可比性）归一化（可比性） 减少假阳性和假阴性减少假阳性和假阴性数据数据 每个孔中能够得到更多每个孔中能够得到更多数据数据 （叠加其它试剂盒）（叠加其它试剂盒） 减少减少了测量变异了测量变异 加样加样+混合混合+检测检测（均相实验）（均相实验） 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 报告基因检测报告基因检测-
31、 -荧光荧光是一种编码可被检是一种编码可被检 测的蛋白质或酶的测的蛋白质或酶的基因，基因， 把把它的编码序列和基因表达调节序列它的编码序列和基因表达调节序列 相融合形成嵌合基因，或与其它目的相融合形成嵌合基因，或与其它目的 基因相融合，在调控序列控制下进行基因相融合，在调控序列控制下进行 表达，从而利用它的表达产物来标定表达，从而利用它的表达产物来标定 目的基因的表达调控，筛选得到转化目的基因的表达调控，筛选得到转化 体体 报告基因报告基因 目的基因目的基因 融合表达蛋白融合表达蛋白 光光 光信号的多少可以代表目的基因表达的情况光信号的多少可以代表目的基因表达的情况 报告基因检测报告基因检测
32、报告基因检测报告基因检测-荧光荧光 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 报告基因检测报告基因检测-荧光荧光 实验步骤：实验步骤： 构建载体构建载体 转染入细胞内转染入细胞内 融合表达蛋白（细胞内表达）融合表达蛋白（细胞内表达） 流式细胞仪流式细胞仪 荧光分光光度计荧光分光光度计 荧光显微镜荧光显微镜 2012 F
33、or research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光法荧光法进行进行钙流检测意义钙流检测意义 胞内钙离子是信息传递的第二信使 介导大量的细胞内生物学反应，如激活一系列的蛋白激酶、 蛋白酶、磷酸化酶和核酶等。 对细胞生长分化起着重要作用 参与神经递质合成与释放、激素合成与分泌 2012 For research use only. Not
34、 for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 采用一些可与钙离子结合的荧光物质，如下两类：采用一些可与钙离子结合的荧光物质，如下两类： 当钙离子存在时，荧光强度增加。 Calcium 3 Assay Kit、Calcium 4 Assay Kit、Calcium6Assay Kit、 Calcium 6 Assay Kit（全新） 钙离子钙离子检测原理和方法检测原理和方法 F F F
35、 F F F F F + CA+ CA+ Injection CA+ CA+ Flex3表现表现 出的优势出的优势 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光强度检测优势和影响因素荧光强度检测优势和影响因素 荧光检测技术优势荧光检测技术优势 灵敏度灵敏度高、特异性好、特性参数多、动态范围宽、无高、特异性好、特性参数
36、多、动态范围宽、无 辐射等辐射等 荧光检测技术影响因素荧光检测技术影响因素 溶液溶液pH值、温度值、温度 、淬灭、自发荧光、淬灭、自发荧光 、光漂白等、光漂白等 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光技术分类荧光技术分类 荧光强度荧光强度 FI 荧光共振能量转移荧光共振能量转移 FRET 时间分辨荧光时间分辨荧
37、光 TRF 时间分辨荧光共振能量转移时间分辨荧光共振能量转移 TR-FRET 荧光偏振荧光偏振 FP 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRET） Frster 共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer ） 原理：使用两种发射
38、光光谱有重叠和能相互吸收的染料, 所以 当这两种染料分子靠的很近的时候（1-10nm）, 能量通过 FRET的机制，会从供体染料分子上传递到受体染料分子上 适合检测适合检测活体中生物活体中生物 大分子纳米级距离和大分子纳米级距离和 纳米级距离纳米级距离变化，变化， 生物大分子生物大分子相互作用相互作用 分析、细胞生理研究、分析、细胞生理研究、 免疫免疫分析等领域分析等领域 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Mo
39、lecular Devices, LLC or their respective owners. 免疫学分析免疫学分析蛋白之间相互作用研究蛋白之间相互作用研究 FRET常用荧光探针选择：传统有机荧光染料、荧光 蛋白、镧系元素 应用： 可以用来监测 蛋白-蛋白, 蛋白-抗体,蛋白质与DNA ，蛋白 构象改变等，核酸杂交技术与 FRET 相结合 , 可用于突变检测、 同源性分析和核酸定量分析等方面 例如：蛋白之间相互作用和蛋白质折叠例如：蛋白之间相互作用和蛋白质折叠 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures.
40、Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 局部环境的变化会引起荧光基团发射特性的改变，也可在单分子水平进行检测 通道病是目前研究领域中重要问题之一（如Alzheimer）， 电测量与FRET技术 的结合可以揭示了离子通道的作用模型 单分子水平研究单分子水平研究离子通道离子通道 反应通道反应通道蛋白质蛋白质 构象动力学的变构象动力学的变 化，同时指示计化，同时指示计 能检测离子流的能检测离子流的 变化情况变化情况 2012 For research
41、use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光共荧光共振能量转移的优势和影响因素振能量转移的优势和影响因素 FRET技技术优术优势势 均相免洗实验、应用领域比较广 FRET影响因素影响因素 分子间有效距离受限、非特异信号干扰、不易检测 较低信号水平 2012 For research use only. Not for use in diagnostic
42、 procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光技术分类荧光技术分类 荧光强度荧光强度 FI 荧光共振能量转移荧光共振能量转移 FRET 时间分辨荧光时间分辨荧光 TRF 时间分辨荧光共振能量转移时间分辨荧光共振能量转移 TR-FRET 荧光偏振荧光偏振 FP 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentio
43、ned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 时间分辨荧光（时间分辨荧光（TRF） TRF (时间分辨荧光时间分辨荧光) 传统荧光染料最大弊端：传统荧光染料最大弊端：荧光寿命短荧光寿命短，易受到，易受到自发荧光干扰自发荧光干扰 染料是一种镧系元素，有着长荧光寿命周期染料是一种镧系元素，有着长荧光寿命周期 (100 sec可可至至2ms) 当被闪烁氙灯激发后当被闪烁氙灯激发后, 其发射光维持的时间要比其发射光维持的时间要比 正常的正常的 荧光素荧光素 长很多（长很多（ns） Stokes
44、 shift变大，消除激发光变大，消除激发光 和散射光的干扰和散射光的干扰 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. TRF技术技术-镧系元素镧系元素 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mention
45、ed herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 原理演示原理演示 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 结果对比结果对比 及及优势优势 2012 For research use only. Not for u
46、se in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 时间分辨荧光的特点和应用时间分辨荧光的特点和应用 时间分辨荧光的特点 低背景 在有干扰信号的情况下也能工作良好： 散射光 短寿命背景荧光 细胞裂解液分析 (高背景荧光样本) 用途 药筛 新生儿筛查 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks
47、mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. 荧光技术分类荧光技术分类 荧光强度荧光强度 FI 荧光共振能量转移荧光共振能量转移 FRET 时间分辨荧光时间分辨荧光 TRF 时间分辨荧光共振能量转移时间分辨荧光共振能量转移 TR-FRET 荧光偏振荧光偏振 FP 2012 For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Trademarks mentioned herein are property of Molecular Devices, LLC or their respective owners. TR-FRET 测定的原理 TRTR- -FRET FRET 结合了结合了 TRF TRF 和和 FRET FRET 的的特点特点 通过能量转移可监测分子结合情况 供体荧光团是镧系元素，发光时间长，供体激发受体，受体发