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1、沉默型pEGFP1. 2. 3 pEGFP-shRNA-wnt3a 质粒转染、扩增及抽提将 pEGFP-shRNA-wnt3a 质粒转染大肠杆菌，LB培养液摇菌过夜，用去内毒素质粒大提试剂盒提取，并于紫外分光光度计中测定质粒浓度，- 20 保存备用。1. 2. 4 pEGFP-shRNA-wnt3a 质粒转染 EPCs 取培养第 7 天生长状态良好的 EPCs,胰酶消化后，用含10% 胎牛血清的 EGM-2 完全培养液重悬成 2 × 106/ml 细胞悬液，按 500 μl / 孔接种于 24 孔板，次日细胞生长达 80% 90% 时开始转染。将细胞用无血清培养液 Opti-
2、MEM 洗 2 遍后，按脂质体 Lipo-fectamine 2000 说明书进行转染，质粒与脂质体比例为 2 μg 3 μl.分为 2 组，沉默型 pEGFP-shRNA-wnt3a 转染组和空白对照组，每组 6 孔。以下以一孔计： 取 2 μg 质粒，加入 Opti-MEM 培养基稀释至 50μl; 另取脂质体 3 μl,加入 Opti-MEM 培养基稀释至50 μl,室温静置 5 min 后将两者混匀，室温静置 20min 形成稳定的脂质体质粒复合物。将上述复合物加入预先滴加 400 μl Opti-MEM 的 24 孔板中，轻轻混匀，置于 37
3、 、5% CO2细胞恒温培养箱中培养，6 h 后换含 10% 胎牛血清的 EGM-2 完全培养液，继续培养 48 h 后在荧光显微镜下激发绿色荧光观察细胞形态以及转染是否成功。各组均在相同条件下进行实验。1. 2. 5 Western blot 法检测 wnt3a 蛋白表达水平转染 48 h 后，提取各组细胞总蛋白，SDS-PAGE 电泳，PVDF 膜转膜，脱脂奶封闭，一抗（ 兔抗 wnt3a 1 500; 鼠抗 β-actin 1 1 000 ） 4 孵育过夜； 次日TPBS 洗膜 3 次，PBS 洗膜 1 次，孵育辣根过氧化物酶（ horseradish peroxidase,H
4、RP） 标记的二抗（ 羊抗兔1 10 000; 羊抗鼠1 10 000） 室温孵育2 h,TPBS洗膜 3 次，PBS 洗膜 1 次，加 ECL 显影剂，于电脑中成像。β-actin 为内参。1. 2. 6 MTT 法检测转染后 EPCs 增殖活性 转染48 h 后，消化收集两组 EPCs,重悬并计数； 再将等量的 EPCs 接种到 96 孔板中，每组细胞置 6 复孔； 于37 、5% CO2的恒温细胞培养箱中培养 72 h,加入MTT 溶液，继续于培养箱中孵育 4 h; 滴加 DMSO150 μl / 孔并置摇床上低速震荡 10 min 后，常规 MTT显色法检测吸光度值。1
5、. 3 统计学处理 采用 SPSS 13. 0 软件进行分析，计量资料以珋x ± s 表示，组间资料比较采用 t 检验。2 结果2. 1 EPCs 培养及鉴定结果 新分离的骨髓源性EPCs 呈圆形，折光性好，体积较小。悬浮于培养液中，第 2 天开始贴壁，体积逐渐增大，由圆形逐渐变为短梭形； 培养至第 7 天可观察到由梭形贴壁细胞生长连接而成的条索，为 EPCs 的特征。收集生长状态良好的 2 代 EPCs 行 CD133、VEGFR-2 双抗体荧光检测及 Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1 荧光检测，可见目的细胞 CD133 及 VEGFR-2 抗原表达阳性，Dil-ac
6、-LDL 及 FITC-UEA-1 表达阳性，表明该梭形细胞为典型的 EPCs.见图 1.2. 2 pEGFP-shRNA-wnt3a 质粒在 EPCs 中的表达 转染 48 h 后，普通光镜下观察见 EPCs 贴壁牢固，细胞形态规则呈梭形或椭圆形，细胞间隙较小，EPCs 生长状态良好； 荧光显微镜下激发绿色荧光观察，见转染组绿色荧光蛋白显着表达，细胞生长状态良好，贴壁牢固，细胞间隙较小，细胞形态规则呈短梭形或椭圆形。见图 2.2. 3 Western blot 法分析转染后 EPCs 的 wnt3a蛋白表达 EPCs 转染 48 h 后，提取细胞总蛋白，经Western blot 法分析。与
7、空白对照组相比，沉默型pEGFP-shRNA-wnt3a 转染组 EPCs 中，wnt3a 蛋白表达明显降低（ P2. 4 MTT 法分析转染后 EPCs 的增殖活性 MTT结果表明，与空白对照组相比，沉默型 pEGFP-shR-NA-wnt3a 转染组中 EPCs 的体外增殖受到明显的抑制（ 0. 364 ± 0. 014 vs 0. 402 ± 0. 013,t = 3. 952,P3 讨论血管 EPCs 是一种能直接分化成为血管内皮细胞的前体细胞，近年来，干细胞移植已成为治疗缺血性疾病与损伤的一种重要方法； 而 EPCs 因取材方便，在血管再生、创伤愈合、肢体
8、缺血和心血管疾病的细胞治疗和基因治疗有广阔的应用前景，所以成为目前的一个研究热点1 -3.自 Asahara et al4在1997 年首次从外周血中成功分离出 EPCs 后，经不断研究，对 EPCs 的认识不断加深，现在的研究5 -6显示成人外周血、脐血及骨髓血中均存在 EPCs,且体外培养过程中能够保持未分化表型增殖达到所需数量，在体外诱导分化可表达内皮细胞特征性抗原。本实验采用大鼠骨髓血密度离心法，并用 EGM-2 完全培养基添加 hEGF、hFGF、VEGF、IGF-1 等生长因子诱导培养，从而获得足够的 EPCs.Wnt 信号通路作为主要的信号转导途径之一，包括经典信号通路和非经典信
9、号通路，参与胚胎及器官发育以及对细胞尤其是干细胞的增殖、分化、迁徙和凋亡等过程起重要的调控作用。Wnt 蛋白通过自分泌或旁分泌作用与细胞膜上的受体结合，从而激活细胞内的信号传导通路。Wnt3a 是 wnt 蛋白家族中重要的亚型之一，通过经典 wnt/β-catenin 信号通路发挥作用，wnt 蛋白与细胞表面受体蛋白 Fzd或 LRP5/6 受体结合形成受体复合物，激活细胞内的 Dsh 蛋白，活化后的 Dsh 蛋白可抑制细胞内 β-catenin 与 APC、GSK-3β、Axin 组成的复合物的形成，引起 β-catenin 在细胞内的积累，并进入细胞
10、核与转录因子 TCF/LEF 结合，激活 wnt 信号靶基因 c-myc、cyclin D1、MMP-7、CD-44 及 Claudin-1 等的转录，从而调控细胞的增殖、分化等过程。文献7 -11报道wnt3a 可促进神经干细胞以及间充质干细胞等干细胞的体外增殖，而 EPCs 作为干细胞中的重要成员之一，对目前的实验研究以及心脑血管等疾病的临床应用具有重要的价值，wnt 通路如何调控 EPCs 的增殖与分化等过程却鲜有报道。本实验以此为背景，用大鼠 EPCs 作为研究对象，购买 wnt3a 沉默质粒，并将其转入 EPCs 中，在倒置荧光显微镜观察有绿色荧光蛋白表达，提示转染成功； 接下来利用
11、Western blot 法分析各组 EPCs 内的 wnt3a 蛋白表达水平，结果提示与空白对照组相比，沉默型 pEGFP-shRNA-wnt3a 转染组 wnt3a 蛋白表达水平显着降低。在此基础上通过 MTT 法观察细胞的增殖能力变化，结果提示沉默型 pEGFP-shRNA-wnt3a 转染组的吸光度值明显低于空白对照组，即增殖能力明显弱于空白对照组。本实验初步揭示了沉默 wnt3a 蛋白对 EPCs 增殖的作用，但是 wnt 信号通路是一个复杂的信号调控网络，wnt3a 以及其他 wnt 家族蛋白对EPCs 的增殖、分化以及凋亡等过程的调控则需进一步的实验证明。综上所述，wnt3a 基因沉默可明显抑制 EPCs 的体外增殖，为进一步研究 wnt 通路对 EPCs 的影响提供了基础。