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1、2/15/2021,In-Fusion克隆技术介绍,2/15/2021,2,基因克隆背景简介,TA克隆,限制性酶切克隆,平滑末端克隆,缺点：连接效率低 耗时较长 需要特定限制性酶切位点,2/15/2021,3,In-Fusion克隆产品,Clontech 专利,In-Fusion HD Cloning System,这是一款让您随心所欲地实现基因定向克隆的产品！,In-Fusion基因克隆特点,4,2/15/2021,5,主要内容,February 15, 2021,6,主要内容,In-Fusion基因克隆技术原理示意图,Clontech专利,In-Fusion是一种快速、简单、高效的基因克隆
2、技术！,7,February 15, 2021,8,主要内容,2/15/2021,9,In-Fusion克隆技术的优点,2/15/2021,10,简便、快速、高效的克隆技术,快速！,2/15/2021,11,In-Fusion HD无论是克隆长基因片段还是克隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。,高效！,简便、快速、高效的克隆技术,2/15/2021,12,不附加任何多余序列,In-Fusion 连接反应15 min,不附加任何多余序列 的重组载体,A,B,C,2/15/2021,13,不受限制性内切酶酶切位点的限制,In-Fusion克隆不受限制性内切酶酶切位点的限制: 在cDNA序列中插入
3、内含子,荧光蛋白基因 在cDNA序列添加UTRs 转换纯化标签例如Myc 转换为His 缺失蛋白表达区域,表达载体,选择插入位点,PCR扩增,纯化,目的DNA片段,混合,引物设计,PCR扩增,重组载体,2/15/2021,14,可同时克隆两个或多个DNA片段,Step 2: 目的DNA片段扩增,Step 3: 一次In-Fusion连接反应,Step 1: 制备线性化载体,片段1,片段2,片段3,线性化载体,重组载体,2/15/2021,15,克服传统克隆技术的限制,2/15/2021,16,In-Fusion克隆技术的应用,多片段克隆,构建载体模型,插入突变位点,高通量克隆,2/15/202
4、1,17,应用实例,2/15/2021,18,引物设计及目的基因片段扩增,引物的5末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列 引物的3末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列,2/15/2021,19,载体线性化,2/15/2021,20,In-Fusion连接反应,In-Fusion专利酶,反应液 直接转化,In-Fusion 连接反应 50 15 min,【结果】,Cloning Enhancer处理，37 15 min， 80 15 min,引物设计原则,引物的5末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列 引物的3末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列,February 1
5、5, 2021,21,引物设计原则,February 15, 2021,22,2/15/2021,23,引物设计网络工具,February 15, 2021,24,主要内容,2/15/2021,25,产品列表,2/15/2021,26,基础款相关产品,5X In-Fusion HD Enzyme Premix pUC19 Control Vector, linearized (50 ng / l) 2 kb Control Insert (40 ng / l),In-Fusion HD Cloning Kit（ 639648/49/50),组分,2/15/2021,27,附带Cloning E
6、nhancer的相关产品,Cloning Enhancer的作用： 消除PCR反应液中的引物二聚体和dNTP等的影响 无需对PCR产物进行胶纯化 操作简单,In-Fusion HD Cloning Kit w/ Cloning Enhancer (639633/34/35),2/15/2021,28,Up to 5X Higher Efficiency,未经处理,Cloning Enhancer处理,Cloning Enhancer的实用例,February 15, 2021,29,主要内容,2/15/2021,30,In-Fusion Kit 常见问答,Q1.如何选择PCR酶？ A1.可以使
7、用任何PCR酶。由于科研人员进行克隆表达的实验较多，我们推荐使用高保真的PCR酶。 Q2.载体和插入的DNA片段末端结构有限制吗？ A2.没有特别的限制。无论是平滑末端、粘性末端或者末端有无A尾均可 进行有效的连接反应。 Q3.载体和插入的DNA片段的长度有限制吗？ A3.没有特别的限制。载体和插入的DNA片段即使超过10 kb也可以进 行连接反应，只是连接效率会有所降低。插入的DNA片段只要不少 于50 bp就可进行有效的连接反应。 Q4.线性化载体末端是否需要进行去磷酸化处理？ A4.线性化载体末端磷酸基团的存在与否不会影响In-Fusion连接效率。 因此，不需要对线性化载体进行去磷酸化处理。,2/15/2021,31,技术支持,：800-810-6261；010-80720985 / 86,： ,： 我们将竭诚为您服务！,Thank You ！,February 15, 2021,32,3Q！,