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1、实验6 -淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测,酶作为生物催化剂,具有专一性和高效性.现在被大量使用在食品、化工、医药等领域。然而，在应用酶的过程中，人们也发现了一些实际问题： （1）不稳定：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活； （2）不利于工业化使用：溶液中的酶很难回收，提高了生产成本，也可能影响产品质量。,怎样解决这些问题呢？,固定化酶技术,一、酶与固定化酶,酶 固定化酶 (固相酶),活细胞产生的具有生物催化作用的生物大分子。,将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。,固定化酶的优点,（1）使酶固定化后有一定的机械强度，催化
2、反应的过程可管道化、连续化和自动化； （2）酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易纯化； （3）固定化酶可反复使用，更经济，更利于工厂化生产； （4）固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间贮存和使用；,固定化酶的不足之处,不能催化一系列反应,二、酶的固定化,机理： 将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。,方法： 吸附法 包埋法 共价偶联法 交联法,目的：,(一)、吸附法 吸附法是将酶与吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。,1、根据吸附剂的特点分为两种：,物理吸附法,离子结合法,通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于固体吸
3、附剂的方法.如有机硅胶、活性炭和石英砂等,利用酶的两性基团和离子交换剂的相互作用（离子键）。吸附量大,（二）、包埋法,将酶包埋在多孔的载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型,是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白的一些基团，在温和的条件下与载体共价结合，形成共价键，从而被固定化。,（三）共价偶联法,是酶分子和多功能试剂之间形成共价键及酶蛋白的氨基相连得到三维的交联网状结构,（四）、交联法,氨基相连处,酶,物理吸附法,交联法,包埋法,酶的固定化方法,固定化酶的性质,稳定性增加： 对热、蛋白酶及各种试剂的稳定性。,pH活性曲线和最适pH的变化： 可能向酸性或碱性方向移动。需实验确定,底物的专一
4、性变化：,三、-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用检测的实验,1、实验目的： （1）制备固定化-淀粉酶； （2）进行淀粉水解的测定。,2、实验原理： 用吸附法将-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示剂溶液（KII2）测试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。,枯草杆菌的-淀粉酶： 最适pH5.57.5 最适温度5575,淀粉,糊精,麦芽糖,葡萄糖,-淀粉酶,-淀粉酶,糖化淀粉酶,遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不显色,3、设备及用品： 5ml塑料注射器、50ml烧杯、滴管、自行车用气门芯及夹子、注射器架、试管或微量离心管3支,4、实验材料及其制备 （1
5、） -淀粉酶的固定化： （2）可溶性淀粉溶液： （3）5mmol/L KI-I2溶液,5mg-淀粉酶+4ml蒸馏水+5g石英砂，搅拌，30min 装入层析柱10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器，流速为1ml/min（约20滴）,50mg可溶性淀粉溶于100ml热水中，搅拌均匀。,0.127g碘+0.83g碘化钾+蒸馏水100ml,完全溶解后装入滴瓶中。,5、实验步骤：,将注射器固定在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液，流速0.3ml/min，（尽量慢）,流出5ml后接收0.5ml（约10滴）流出液,加入12滴KI-I2溶液，观察颜色,用水稀释1倍后再观察颜色（与对照组比较）,实验后，10倍柱体积蒸馏水洗
6、涤此柱，放置在4冰箱中,几天后重复实验，观察结果,淀粉溶液+指示剂： 亲和层析洗脱液+指示剂： 贮于冰箱几天后重复实验：,6、实验结果：,呈蓝色,呈红色,呈红色,固定化酶的用途,在工业上的应用： 柚苷酶固定化酶用于果汁脱苦； 木瓜蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清； 葡萄糖异构酶固定化酶用于制造果糖，提高甜度。,在化学分析和临床诊断上的应用： 用脲酶固定化酶测定血液或尿中的尿素含量。,在医药上的应用： 将苯丙氨酸羟化酶及其辅酶制成不溶酶，注射到患者体内，可有效治疗苯丙酮尿症。 缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛腹泻，可用乳糖酶固相酶在体内或体外水解乳糖。,1、试验中为什么要待固定化酶柱中流出5
7、ml液体后再接收流出液用于鉴定？,讨论,答案：因为固定化酶柱中的酶与流经柱子的淀粉反应需要一定的时间，刚开始流出的液体中由于反应时间过短，糊精未生成或生成的量太少，所以不利于后面的颜色鉴定。,2、如何证明洗涤固定化淀粉酶柱的流出液中没有淀粉酶？,答案：可在试管中加入1ml可溶性淀粉溶液，再加入几滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住试管增加温度，几分钟后加入1滴KI-I2指示剂，如仍显蓝色，即流出液中没有淀粉酶了。 用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶液，使其自柱中流出，作用的结果才能表明是淀粉酶的固相酶作用的结果。,3、耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途？,答案：在实际生产中，总希望反应的时间越短
8、越好，这就要提高反应温度。通常生产上淀粉酶是一次性使用的，加温虽在短时间内会使酶变性失活，但只要使淀粉在短时间内水解即可。 寻找耐高温的淀粉酶的目的是在高温下使淀粉水解快，而且酶不会因高温而在短时间内变性。在发酵生产中使用的往往是植物淀粉，如青霉素发酵、乙醇发酵等都要水解淀粉，所以耐高温淀粉酶用途广泛。,1、pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。 2、离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度 增加，吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比 小分子慢得多。 6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越 强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。,2.影响酶在载体（吸附剂）上吸附程度 的因素:,