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1、利用一种耐热耐糖葡萄糖苷酶制备黄芩素的研究 对利用一种耐热耐糖β葡萄糖苷酶水解黄芩苷制备黄芩素进行了研究。该酶催化黄芩苷转化为黄芩素的反应能在醋酸醋酸钠缓冲液中良好地进行，酶的最适pH 5.5，最适反应温度85 ，温度在85 以下，pH 57.5酶的稳定性良好。酶的最大反应速率Vmax为0.41 mmol-L-1-min-1，米氏常数Km为3.31 mmol-L-1。不同的金属离子对酶的活性有不同的影响，醋酸醋酸钠缓冲液中的Na+对酶有活化作用。反应体系中葡萄糖醛酸浓度低于0.6 mol-L-1时，对酶有活化作用，当单糖浓度大于0.6 mol-L-1时，对酶有抑制作用，当单糖浓度达到
2、1.2 mol-L-1时，酶活抑制率为50%，糖耐受性较好。通过实验得出较佳反应条件为黄芩苷酶液1 g0.2 mL，pH 5.5的醋酸醋酸钠缓冲液，反应时间为10 h时，反应温度为85 ，酶解率可达97%。 耐热；耐糖；β葡萄糖苷酶；黄芩苷；黄芩素黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，首载于我国古代第一部本草著作神农本草经，其药用历史悠久，是我国广泛应用的传统名贵中药材之一。黄芩苷和黄芩素为中药黄芩中的主要有效成分，文献记载具有解热镇痛抗炎、抗菌抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、保护心脑血管、保护神经、保肝、治疗或预防糖尿病及其并发症、增强免
3、疫、抑制变态反应等作用 。黄芩中黄芩素含量很低，但是黄芩苷的含量很高，可达7%19%【4】。而黄芩苷在人体内吸收差、 转化率低，研究表明：黄芩苷在肠内经过菌群作用转化为黄芩素而吸收，然后再于体内还原为黄芩苷，黄芩苷口服制剂需经胃肠道菌丛酶解转化为黄芩素后被吸收。黄芩素的生物利用度和药理活性均高于黄芩苷，如抗艾滋病毒、诱导感染鸭子病毒细胞的凋亡，抑制艾滋病毒逆转录酶等作用等均远高于黄芩苷【7】，但在黄芩中黄芩素含量却很低、 而且易被氧和碱破坏、 生产成本高，从而使其应用受到了很大的限制。为此，人们致力于研究将黄芩苷转变为黄芩素。随着生物技术的发展，酶作为催化剂有专一性好，催化效率高，对环境污染小
4、，且反应条件温和等优点，在工业应用上也正在越来越多地替代传统意义上的催化剂。本文研究了利用一种来源于热袍菌Thermotoga petrophila DSM 13995的β葡萄糖苷酶通过对黄芩苷的酶解来制备黄芩素的方法。1材料IKA磁力搅拌器；pH计（MettlerToledo FE20）；EYELA旋转蒸发仪；BurkerAV400 型核磁共振光谱仪； AE240 电子分析天平 （瑞士 Mettler公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪；752紫外可见分光光度计， 上海光谱仪器有限公司； 黄芩苷自制，纯度95%（HPLC测定）；β葡萄糖苷酶；95%乙醇（食用级，
5、连云港长和酒业有限公司）；黄芩苷，自制，纯度98%（HPLC测定）；黄芩素自制，纯度 98%（HPLC 测定）；HPLC用试剂（色谱纯，Oceanpak，瑞典）；其他试剂均为分析纯。2方法2.1β葡萄糖苷酶的制备和酶活力的测定2.1.1β葡萄糖苷酶的制备 由南京林业大学赵林果教授实验室提供，其制备过程简述如下：将极端热袍菌T. petrophila DSM 13995中β葡萄糖苷酶基因（Tpebgl3）克隆转化到大肠杆菌JM109（DE3）宿主菌（购自Novagen公司），在含有氨苄青霉素（50 mg-L-1）的LB平板（LB培养基：胰蛋白胨10 g-L-1，酵母
6、提取物5 g-L-1，NaCl 5 g-L-1，琼脂15 g-L-1）上经过37 培养过夜，挑转化子到200 mL的LB培养基中（50 mg-L-1氨苄青霉素）37 ，200 r-min-1振荡培养至A600为0.6 h，加入终浓度为0.5 mmol-L-1异丙基βD硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导剂，30 培养6 h，用高速冷冻离心机将培养液在4 下，以13 000 r-min-1离心15 min，收集菌体，破碎菌体后加入缓冲盐，离心取上清液，经Ni亲和色谱柱纯化即得。2.1.2酶活力的测定 准确称取黄芩苷1.0 g，加入到500 mL缓冲溶液中（用醋酸钠和0.5 mol-L-1的
7、醋酸配制，pH 5.5） ，搅拌均匀，油浴加热至85 时再加入β葡萄糖苷酶溶液0.2 mL，反应10 min后，加入50 mL 1 mol-L-1Na2CO3溶液终止反应，用DNS法测定生成的葡萄糖醛酸的含量。酶活力定义为：在最适反应条件下，每1 min水解黄芩苷释放出1 μmol 葡萄糖醛酸所需要的酶量为1个酶活力单位（U）。测得酶的活力为80 U-mL-1。2.2黄芩苷酶解率测定方法2.2.1黄芩素标准曲线的建立 精密称取恒重的黄芩素10.0 mg，乙酸乙酯溶解并定容至100 mL，得黄芩素对照品溶液。分别取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL对照品
8、溶液于10 mL量瓶， 乙酸乙酯定容，配成7.4，14.8，22.2，29.6，37.0，44.4，51.8 μmol-L-1的黄芩素溶液。 以乙酸乙酯为空白，275 nm处测吸光度A。 以黄芩素浓度（C，μmol-L-1） 对A进行线性回归，标准曲线方程为A=1.328 7C+17.6，r=0.999，说明黄芩素在7.451.8 μmol-L-1内线性关系良好。2.2.2酶解率的测定 测定时，用乙酸乙酯回流提取酶解样品液数次，合并乙酸乙酯并补至500 mL， 取10 mL稀释100倍后于275 nm处测吸光度A， 根据黄芩素标准曲线及下式计算酶解率。酶解率=5x10-5xC
9、xMg/mx100%上式中C为黄芩素浓度（μmol-L-1）；m为黄芩苷质量（g）；Mg为黄芩苷相对分子质量。2.3酶解反应速率的测定在酶解一定时间（t，min）的样品液中加入适量乙酸乙酯回流，终止酶解反应同时提取酶解样品液， 按2.2.1测定吸光度， 并按黄芩素标准曲线和下式计算酶解反应速率vs（以产物黄芩素的增加量为准，C， μmol-L-1； vs， mmol-L-1-min-1）：vs =C/（1 000T）。2.4不同因素对酶解反应的影响2.4.1酶的最适反应温度 分别在60，65，70，75，80，85，90，95，100，105 下按照2.1.2所述的方法测定&bet
10、a;葡萄糖苷酶活力，取吸光度最高时的温度为最适反应温度。2.4.2酶的最适反应pH 分别用pH为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的醋酸醋酸钠缓冲液按照2.1.2所述的方法测定β葡萄糖苷酶活力，取吸光度最高时的pH为最适反应pH。2.4.3酶的热稳定性 在最适pH条件下，将酶分别置于不同温度70，80，90，100，105 中，水浴保温2 h，然后按照2.1.2所述的方法测定相应的酶活力。2.4.4酶的pH稳定性 将酶置于pH为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5的醋酸醋酸钠缓冲溶液中，在最适反应温度条件下
11、保温2 h，然后按照2.1.2所述的方法测定相应的酶活力。2.4.5加酶量对酶解率的影响 称取9份1.0 g的黄芩苷分别于9个500 mL三角瓶中， 加入pH 5.5的醋酸醋酸钠缓冲溶液500，499.9，499.8，499.7，499.5，499.0，498，497，496 mL，分别加入酶液0，0.1，0.2，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL， 于85 酶解2 h， 按2.2.2测定酶解率。2.4.6酶解时间对酶解率的影响 称取6份1.0 g的黄芩苷于6个500 mL三角瓶中，各加入pH 5.5的醋酸醋酸钠缓冲溶液499.8 mL，然后各加酶0.2 mL，于85 分别酶
12、解2，4，6，8，10，12，14 h， 按2.2.2测定酶解率。2.4.7温度对酶解率的影响 称取5份1.0 g的黄芩苷于5个500 mL三角瓶中，各加入pH 5.5的醋酸醋酸钠缓冲溶液499.8 mL，然后各加酶0.2 mL，分别于75，80，85，90，95 下反应10 h，按2.2.2测定酶解率。2.4.8金属离子对酶活力的影响 研究Hg2+，Mg2+，Ca2+，Na+，Al3+在2种不同浓度1，5 mmol-L-1下对该酶促反应的影响，每种反应体系均在85 下活化10 min后加入黄芩苷反应1 h，另设不加金属离子为空白对照，然后测定酶的活力。2.4.9酶解产物葡萄糖醛酸对酶活力的影
13、响 将酶置于葡萄糖醛酸浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mol-L-1， pH 5.5的醋酸醋酸钠缓冲溶液中，另设不加葡萄糖醛酸的空白对照，在最适反应温度条件下保温2 h，然后测定酶的活力。2.4.10酶促反应动力学参数的测定 米氏常数Km和最大反应速率vmax是酶促反应最重要的2个特征参数，其测定方法如下：精密称取0.223 g黄芩苷于100 mL量瓶中，加入pH 5.5的醋酸醋酸钠溶液适量使完全溶解，最后定容至100 mL，配成50 mmol-L-1的黄芩苷溶液。再分别吸取0.8，1.6，2.4，3.2，4.0，4.8，5.6，6.4 mL于10 m
14、L量瓶中，定容至刻度，配成底物浓度Cs为4，8，12，16，20，24，28，32 mmol-L-1的黄芩苷溶液，按照2.3测定Vs。2.5黄芩素的分离纯化反应液冷却后用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩干燥后，再加适量的乙酸乙酯、甲醇或乙醇使溶解完全，静置结晶。通过重结晶得到高纯度黄芩素。2.6分析方法采用核磁共振波谱检测黄芩苷和黄芩素的结构。采用HPLC测定黄芩苷和黄芩素的纯度，色谱条件：Acuity 色谱柱（4.6 mmx250 mm，5 μm）， 流动相甲醇水甲酸（68320.5），流速1 mL-min-1，柱温25 ，进样量20 μL，检测波长275 nm。用外标法作标准曲线，计算
15、样品浓度。3结果与讨论3.1黄芩苷样品的检测3.1.1黄芩苷样品的纯度检测 经HPLC检测，黄芩苷样品的纯度在95%以上，见图1。3.1.2黄芩苷样品的结构检测HNMR（DMSOd6，400 MHz）δ：12.60（活泼H，5OH），8.69（活泼H，6OH），8.07（2H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H2′，6′），7.60（3H，m，H3′5′），7.06（1H，s，H3），7.01（1H，s，H8），4.08（1H，d，J=9.5 Hz，HG1，糖端基上的H）；13CNMR（DMSOd6，100 MHz）δ： 163.6（C2），106.2（C3），182.6（C4），146.8（C5），130.6（C6），151.3（C7），93.7（C8），149.2（C9），104.8（C10）dYLW.nET，130.9（C1′），126.4（C2′，C6′），129.2（C3′，C5′），132.1（C4′），99.9（CG1，糖端基上的碳），72.8（CG2），75.3（CG3），71.4（CG4），75.5（CG5）170.1（CG6）。以上数据与参考文献报道的黄芩苷的数据一致，故确定该化合物为黄芩苷。