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1、地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析 酪氨酸脱羧酶TyDC是植物次生代谢的催化酶，在苯乙醇苷类成分的生物合成中发挥重要作用。根据地黄转录组数据，克隆了地黄酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC的全长cDNA序列（GenBank登录号KU640395），并进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR（qRTPCR）检测其在地黄不同组织及4种诱导子处理后毛状根中的表达量。结果表明，RgTyDC ORF为1 619 bp，编码509个氨基酸，相对分子质量为56.6 kDa，等电点pI 6.25。RgTyDC与芝麻酪氨酸脱羧酶SiTyDC和猴面花酪氨酸脱羧酶EgTyDC的同源性最高，均为88%。RgTyDC基因在
2、叶片（尤其是衰老的叶片）中表达量较强，在块根中表达量较低。SA和MeJA处理后显著上调表达。这为进一步研究RgTyDC在地黄苯乙醇苷类成分生物合成中的分子功能奠定基础。 地黄； 酪氨酸脱氢酶； 克隆； 诱导子； 表达地黄Rehmannia glutinosa L.为玄参科多年生草本植物，以块根入药，是我国著名的四大怀药;之一，为常用大宗药材，具有重要的药用价值和经济价值。其道地产区在河南古怀庆府（现焦作的温县、武陟、沁阳、博爱等地），山东、山西、黑龙江、甘肃等地也都有较大的种植面积。目前在河南省焦作市（道地产区）种植面积已逾1.5万hm2，产值在数十亿元【1】。研究表明，地黄含有丰富的苯乙醇苷
3、类成分。苯乙醇苷类（phenylethanoid glycosides，PhGs）成分是一类由苯乙醇苷元与糖基结合而成的苷类化合物，又由于多数化合物糖上连有咖啡酰基或阿魏酰基，又称其为苯丙素类化合物（phenylpropanoid glycosides，PPGs）【4】。玄参科、列当科、马鞭草科、唇形科、木犀科、车前科等多种双子叶植物中均有分布，具有抗菌、抗炎、抗氧化、免疫调节、保肝、抗肿瘤等多种药理性【5】。目前关于植物苯乙醇苷类成分生物合成的分子机制研究报道较少。推测这类成分的母核来源于桂皮酸途径生成的酪氨酸，酪氨酸在酪氨酸脱羧酶（tyrosine decarboxylase，TyDC）作
4、用下生成酪胺，并在酪胺羟化酶（tyramine hydroxylase，TyH）作用下生成多巴胺，或是酪氨酸在酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）作用下生成多巴，在多巴脱羧酶（DOPA decarboxylase，DODC）作用下生成多巴胺，多巴胺再经一系列酶催化生成苯乙醇苷类成分（图1）。TyDC是合成苯乙醇苷类的关键限速酶，在苯乙醇苷母核的形成中发挥重要的作用。目前仅在模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana【6】、水稻Oryza sativa【7】和药用植物罂粟Papaver somniferum、红景天Rhodiola rosea、马兜铃Aris
5、tolochia contorta等克隆了TyDC基因。本文根据已经报道的TyDC基因的信息，在课题组前期测定的转录组数据库中通过同源比对获得了4条EST序列，通过设计特异引物，应用RTPCR的方法克隆出地黄TyDC基因，进行序列比对和系统进化分析，组织表达和诱导子处理表达特性分析，为阐明地黄毛蕊花糖苷为代表的苯乙醇苷类成分的分子调控机制提供参考。1 材料和方法1.1 样品 以地黄温855;为实验材料，经由河南农业大学中药材系高致明教授鉴定为R. glutinosa。种植于河南农业大学百草园中药材教学园区，在地黄出苗后90 d取块根、须根、茎、老叶、初展开叶和嫩叶的鲜样，在液氮中保存。以实验室
6、培养的发根农杆菌A4诱导的温855;毛状根体系为诱导子处理的材料。1.2 RNA的提取与反转录 每个样品取材约50 mg，以MiniBEST试剂盒（TaKaRa，大连）进行柱式法提取地黄总RNA，提取方法参考说明书进行。反转录采用反转录试剂盒（TaKaRa，大连），用于cDNA第一链合成需要2 g 的总RNA，1 μL oligo dT （50 μmol-L-1）引物，1 μL dNTP，0.5 μL RNase抑制剂（40 U-μL-1），1 μL PrimeScript 反转录酶（200 U-μL-1），终体积为20 μL。反应条件为：65
7、5 min，42 60 min，之后95 5 min。1.3 基因克隆 以拟南芥Arabidopsis thaliana AtTyDC的cDNA（NM_179668.1）为查询序列，在本课题组前期测定的转录组EST数据库中进行同源搜索，应用序列分析工具DNAMAN和DNASTAR对获得的EST序列进行冗余序列剔除和拼接。根据cDNA序列设计4条特异引物F1：5′ATGGAGGGTGATTTGAAGCC3′；R1：5′TTGGCAAAGACTGAACAACATC3′；F2：5′CTTCCTTTTCAGCAGTAGCAA3′；
8、R2：5′TAAAACAGGGCGCAGCAGACAG3′。以 温855;叶片cDNA为模板，用PrimeSTAR高保真酶（TaKaRa，大连）进行PCR扩增，克隆RgTyDC的编码序列（CDS）。PCR扩增体系：5xPrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）10 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol-L-1）4 μL，Forward Primer（10 μmol-L-1）和Reverse Primer（10 μmol-L-1）均为1 μL，模板 cDNA 0.5 μL，PrimeSTAR HS DNA Po
9、lymerase（2.5 U-μL-1）0.5 μL，灭菌蒸馏水33 μL，共计50 μL。反应条件：98 10 s，58 5 s，72 1 min，30个循环；72 10 min。1.4 蛋白序列分析 以NCBI在线分析工具ORF Finder（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找基因开放阅读框（ORF）。应用NCBI结构域在线工具（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析氨基酸序列保守结构域。采用SWISSMODEL（http：/swissmodel
10、.expasy.org/）进行蛋白质二级结构分析和三维建模。氨基酸多序列联配用Clustal Omega（http：/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/），进化树构建利用在线分析软件MAFFT和离线软件MEGA 6.0软件进行。1.5 诱导子处理 课题组以发根农杆菌A4诱导的温855毛状根转化系855A41（继代12次）为处理材料，培养20 d后添加诱导子。诱导子种类和终浓度为：水杨酸（SA）25 μmol-L-1，Ag+ 15 μmol-L-1，茉莉酸甲酯（MeJA）15 μmol-L-1，腐胺（Put）15 μmol-L-1。分别在添
11、加诱导子后3，9，12，24 h取样，在液氮中保存，以未添加诱导子的毛状根转化系为对照。1.6 基因表达量检测 提取地黄组织和诱导子处理的毛状根的总RNA用于qRTPCR检测。所用PCR仪器为BIORAD IQ5（伯乐，上海）。根据选取候选RgTyDC基因的CDS序列信息设计特异引物5′ACCGTCTGCTTCTGCATATC3′和5′TACCCGATTCGTTAATCGCC3′（扩增产物长度为124 bp）。以地黄TIP41like蛋白编码基因（RgTIP41，GenBank注册号KT306007.1）为内参基因，引物序列为5′TG
12、GCTCAGAGTTGATGGAGTG3′和5′TCTCCAGCAGCTTT CTCGGA3′。实时荧光定量分析试剂盒为SYBR Premix Ex TaqTM （Tli RNaseH Plus） （Takara，大连）。PCR扩增体系：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μl，Forward Primer（10 μmol-L-1）1 μL，Reverse Primer（10 μmol-L-1）1 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，共计25 μL。反应条件：95 30 s；9
13、5 5 s，60 30 s，40个循环。参考文献根据BIORAD iQ5 软件生成的Ct（cycle threshold）值，以2ΔΔCt计算RgTyDC基因的相对表达量2 结果与分析2.1 RgTyDC基因克隆 在地黄转录组数据库中，通过同源搜索、拼接和延伸，获得Unigene7381，Unigene15405，Unigene10894，Unigene71250共4个片段，大小分别为704，530，801，893 bp，然而序列拼接并不能获得完整的ORF。NCBI上BLASTn分析发现Unigene7381_All和Unigene10894可能是地黄TyDC的5&pr
14、ime;端，包含起始密码子ATG，另外2个序列Unigene15405和Unigene71250可能是TyDC的3′端，包含终止密码子TAA。分别在4个片段上设计特异引物，合成后的引物按照同样的比例混合后用于PCR扩增，结果获得1条在1 0002 000 bp的条带（图2），测序结果表明片段长度为1 619 bp，包含1个1 530 bp的ORF，编码509个氨基酸，命名为RgTyDC。序列已经提交到NCBI，GenBank登录号为KU640395。2.2 RgTyDC的序列特征分析 应用ExPASy（http：/web.expasy.org/protparam/）计算发现RgTy
15、DC蛋白的相对分子质量为56.6 kDa，等电点pI 6.25。应用NCBI在线工具（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析其保守的结构域，发现从第12至507 aa为保守结构域PLN02880，注释为酪氨酸脱羧酶；从第96 aa至502 aa含有1个多巴脱羧酶家族（DOPA_deC_like family）蛋白结构域。与已经发表的人类（Homo sapiens）、野猪（Sus scrofa）、拟南芥的TyDC/DODC进行多序列联配，发现它们之间共享保守的结构域Pyridoxal_deC，地黄RgTyDC与人、野猪、拟南芥T
16、yDC/DODC的序列一致性分别为42%，42%，56%（图3）。下划线显示Pyridoxal_deC结构域，箭头显示保守的激活位点赖氨酸K残基，星号显示与激活位点作用的天冬氨酸D残基；其他物种的TyDC/DoDC登录号如下：HsDODC（Homo sapiens），NP_000781.1；SsDODC（Sus scrofa），NP_999019.1；AtTyDC（Arabidopsis thaliana），NP_849999.1。2.3 RgTyDC的3D结构预测 用SWISSMODEL在线软件http：/swissmodel.expasy.org/interactive）进行3D建模结果显
17、示，RgTyDC蛋白空间上包含22个α螺旋和14个β折叠。同时发现，RgTyDC蛋白与已经发表的野猪多巴脱羧酶蛋白1js6.1.A的三级结构十分相似，序列同源性为45.67%，用于建模的氨基酸残基范围为21507位（图4）。2.4 RgTyDC的系统进化分析 利用地黄RgTyDC蛋白的氨基酸序列在NCBI上进行BLASTp同源搜索，获取19个物种的TyDC/DODC/AADC蛋白。以MAFFT对它们与RgTyDC进行多序列联配，用MEGA 6.0软件以NeighborJoining算法进行bootstrapping分析，构建系统发生树（图5），结果把20个蛋白分为2个大类
18、群，5个动物TyDC同源蛋白和15个植物TyDC同源蛋白分别聚在一起，符合物种进化规律。地黄、猴面花Erythranthe guttata、芝麻Sesamum indicum这3种植物均属于管状花目，RgTyDC与SiTyDC，EgTyDC的序列一致性最高，均为88%，聚在同一分支，可信度为99%。马铃薯Solanum tuberosum、野生烟草Nicotiana sylvestris和野生番茄S. pennellii均为茄科植物，其同源蛋白属于同一类群。高粱Sorghum bicolor和水稻同为单子叶禾本科植物，SbTyDC，OsTyDC属于同一类群。另外，大豆Glycine max G
19、mTyDC和野生大豆G. soja GsTyDC聚在一起。2.5 RgTyDC基因在地黄不同组织中的表达 以地黄RgTIP41基因作为内参，采用定量qRTPCR分析RgTyDC基因在地黄不同组织中的表达量，结果表明，RgTyDC基因在检测的6个地黄组织中均有其他物种TyDC/DoDC的登录号如下：SiTyDC（Sesamum indicum），XP_011096642.1；Oe（Olea europaea），AFS28699.1；Vv（Vitis vinifera），XP_010655699.1；St（Solanum tuberosum），AHI16968.1；At（Arabidopsis t
20、haliana），NP_849999.1；Gm（Glycine max），XP_003535055.2；Os（Oryza sativa），NP_001059509.1；Sb（Sorghum bicolor），XP_002459778.1；Ac（Aristolochia contorta），ABJ16446.1；Gs（Glycine soja），KHN22980.1；Eg（Erythranthe guttata），EYU19150.1；Tc（Theobroma cacao），XP_007041097.1；Ns（Nicotiana sylvestris），XP_009773392.1；Sp（S.
21、pennellii），XP_015068377.1；Ss（Sus scrofa），NP_999019.1；Hs（Homo sapiens），NP_000781.1；Dr（Danio rerio），NP_998507.1；Mm（Mus musculus），NP_057881.1；Dm（Drosophila melanogaster），NP_724489.1。RgTyDC的表达量。结果表明，在添加SA后RgTyDC的表达量在各个检测时间均极显著高于未添加对照，12 h达到最高，为未处理对照的25.02倍，说明SA能够诱导RgTyDC的表达。添加Ag+后9 h，RgTyDC的表达量略高于对照，24
22、h时约为对按照的0.44倍，其他时间点相比对照没有变化。添加MeJA后检测的各个时间点RgTyDC的表达量均高于对照，3 h时为对照的16.76倍，之后表达量逐渐降低，24 h时约为对照的1.88倍，说明MeJA也能够诱导RgTyDC的表达。添加Put后3 h，RgTyDC的表达量高于对照（为对照的4.28倍），9 h降低为对照的2.11倍，12 h和24 h与对照没有差异（图7）。3 讨论酪胺和多巴胺是合成异喹啉类生物碱和苯乙醇苷前体，是在TyDC和DODC脱羧酶作用下酪氨酸和多巴脱去羧基后生成的。TyDC（EC 4.1.1.25）和DODC（EC 4.1.1.28）都属于氨基酸脱羧酶，Sa
23、ndmeier等把它们都归为第组。这类氨基酸脱羧酶在包括细菌、真菌、动物、植物不同物种中都比较保守，其氨基酸序列具有较高的一致性。本研究发现地黄TyDC与人、猪的DODC序列一致性均高于40%，与拟南芥TyDC的序列一致性为56%，而与管状花目植物猴面花、芝麻TyDC的序列一致性更是高达88%。多序列联配发现地黄、拟南芥、人和猪的同源蛋白存在非常保守的结构域（图3）。同时在进化上符合物种进化规律，动物和植物之间的序列一致性较高，亲缘关系近的物种聚在一起。前人研究发现，植物中TyDC基因具有组织表达特异性，而且与以酪氨酸为前体的次生代谢产物积累有较强的相关性。TyDC1在罂粟根中表达量较高，Ty
24、DC2在罂粟根和茎中表达量较高，2个基因在叶中表达都很弱。红景天苷主要在红景天根中积累，TyDC基因在根中表达量较叶片高，红景天苷含量高的株系TyDC基因的表达量也高。地黄TyDC基因在叶片中表达量较块根高，毛蕊花糖苷含量叶片高于块根，这说明RgTyDC可能参与地黄毛蕊花糖苷的生物合成。TyDC基因还能够响应诱导子的诱导而提高表达，进而调控下游次生代谢产物的合成。在拟南芥中，干旱和受伤均能够诱导TyDC基因的表达，而低温、盐、热和黑暗则不同程度抑制TyDC基因的表达【6】。TyDC基因在大花红景天Rhodiola crenulata在SA和MeJA处理后的毛状根中表达量都有增加，SA处理的表达
25、量增加幅度最大，毛状根红景天苷含量也在2种诱导子处理后大幅提高，且SA处理的红景天苷含量增幅最大。本实验中，SA和MeJA处理后，地黄毛状根中RgTyDC的表达量均极显著增加，不同的是SA处理12 h RgTyDC表达量增幅最大，MeJA处理后3 h RgTyDC表达量增幅最大。这与前人的研究结果类似，说明RgTyDC可能编码一个参与地黄苯乙醇苷类成分生物合成的关键限速酶。【1】 郭冠瑛，王丰青，范华敏，等. 地黄化感自毒作用与连作障碍机制的研究进展. 中国现代中药，2012，14（6）： 35.【2】 Jiménez C， Riguera R. Phenylethanoid glycosides in plants： structure and biological activity . Nat Prod Rep， 1994， 11（6）： 591.出处：中国中药杂志