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1、大分子拥挤环境下多糖对蛋白肽的修饰研究 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.2 齐军茹，翁静宜，卓秀英，康燕辉，冯纪璐，杨晓泉 （华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640） 摘要：采用胃蛋白酶适度水解大豆分离蛋白得到蛋白肽，在大分子拥挤环境下通过Maillard反应制备蛋白肽-葡聚糖共价复合物（Hydrolated Soy Protein Isolated-Dextran Conjugates，HDC），采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术证实大豆7S热稳定性、抗氧化性和乳化性
2、能进行系统分析。结果表明：大分子拥挤环境下大豆水解蛋白肽-葡聚糖60 接枝度的共价复合物，溶解性较大豆分离蛋白（Soybean protein isolated，SPI）和大豆分离蛋白-Conjugates，SDC）有所提高，热稳定性好，HDC羟自由基清除率高于维生素C，HDC的乳液粒径最小并具有优越的乳化稳定性。 关键词：大分子拥挤环境；胃蛋白酶；糖肽；葡聚糖；Maillard反应 文章篇号：1673-9078(2015)2-26-31 QI Jun-ru, WENG Ji-lu, YANG Xiao-quan Abstract: for 4h had superior function o
3、n the grafted degree, thermal stability, oxidation First, pepsin was introduced for enzymolysis of soybean protein In macromolecular crowding Maillard and enzymatic were combined for the protein glycosylated reaction, the structure of protein, promoting the exposure ofKey words: Maillard反应机理的-氨基连接到多
4、糖分子的还原端1现引入多糖形成共价复合物后，蛋白质的溶解度、抗氧化性、抗菌性以及热稳定性等性能提高；将酶法和化学法有效结合起来对蛋白质进行改性是目前蛋白质改性研究的热点。 收稿日期：2014-06-11 基金项目：国家自然科学基金青年面上连续资助项目（31370036） 作者简介：齐军茹（1977-），女，副教授，研究方向：蛋白质化学与工程 2 大分子拥挤体系这一概念首次是由DanZhu等人于2008年引入到功能性食品体系中的。“大分子拥 挤”是生命科学领域中的研究热点，生命细胞内含有大量的大分子物质如多糖、蛋白质、核酸等，大分子在细胞体系中浓度达到7%40%时，就会使细胞内环境变得异常拥挤2
5、，大多数的生化反应实际是在这种拥挤的环境体系中完成的。当体系中存在有高浓度的生物大分子时，大分子之间的反应遵循分子排斥容积 3 理论，促进反应向溶质总体积减小的方向，即朝结合方向移动4；另外，大分子拥挤环境下蛋白质分子构型趋于稳定，蛋白质变性程度以及聚集程度将会减轻56。因此，近几年生命科学家强烈建议把“大分子拥挤”环境与pH、离子强度和溶液组成等因素一样用 26 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.2 于研究生物大分子，加入拥挤物质逐渐成为一种研究大分子的途径，从而加深对分子间相互作用的了解。在食品工业中，高效
6、率是一个重要的因素，缩短反应时间可以更好的促进反应的进行，提高生产效率。蛋白质分子中加入酶制剂可以打开肽链促进接枝反应的进行，从而大大缩短反应时间。采用蛋白酶水解蛋白，能够有效地打开蛋白大分子的三级空间结构，同时将蛋白的长肽链切断成中长链，使更多的-氨基基团暴 离子水进行搅拌，调节pH为8.0，室温搅拌2 h后10000 g离心30 min。调节上清液的pH为4.5，在4 条件下静置30 min后8000 g离心10 min得到沉淀。多次漂洗沉淀后，以1:10的料液比加入去离子水，调节pH为7.5，搅拌使其充分溶解，在4 下透析48 h，冷冻干燥得到SPI样品。 1.3.2 胃蛋白酶水解大豆分
7、离蛋白 称取5.0 g的大豆分离蛋白溶于50 mL，pH 7.0，CR22G，日立(Hitachi)公司；冷冻干燥机，Christ，博劢行仪器有限公司；酸度计，pHs-3C，上海雷磁仪器厂。 依据Laemmli的方法进行SDS-PAGE。分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，电极缓冲液（含SDS）为Tris-甘氨酸缓冲液（pH约为8.3），上样量为10 L。加样后电流设定为40 mA，样品进入浓缩胶后，改为80 mA，当电泳跑至距离电泳槽橡胶底边约1.5 cm时，关闭电源。分别用考马斯亮蓝R-250试剂和PAS染色法对凝胶胶片进行蛋白质及糖染色。 27 8 1.3 试验方法 1.3.1 大豆分
8、离蛋白的制备 粉碎后的低温脱脂豆粕按1:10的料液比加入去 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 9 2015, Vol.31, No.2 1.3.6 溶解性的测定 参考Kato等的方法。称取一定量的待测品溶于去离子水中，浓度为1 mg/mL，调节溶液的pH值（2.010.0），室温下搅拌30 min（搅拌过程中取样测定并保持pH）后，4 离心15 min(10000 g)，上清液中蛋白浓度以280 nm吸光值表示(A280)。蛋白质的溶解性表示为上清液蛋白浓度占相应的总蛋白浓度的百分比（A280/A总100%）。上清液中蛋白质含量与原蛋白含量的比
9、值即为溶解度指标，三次平行实验取平均值对已溶解样品的质量百分比与pH做曲线，分析待测样品的溶解性。 度的样品浓度，往试管中分别加入2 L H2O2 (30%，m/V)，37 水浴反应60 min后于536 nm处测定吸光值。三次平行实验取平均值对清除率和样品浓度做曲线以Vc做阳性对照。 清除率/%?(As?A1)/A0?A1)?100 注：A0为空白样；A1为对照样的吸光值。 1.3.9 乳化活性的测定 样品用去离子水配制成质量分数为2%的溶液，加入体积分数为20%高压均质2次，再用去离子水按质量比为采用粒度 置：颗粒折射率为1.520 1.3.7 热稳定性的测定 样品溶于pH 7.0的磷酸盐
10、缓冲液中，蛋白浓度5 mg/mL (m/V)，以不同的温度（3090 ）水浴1 h，然后迅速冷却至室温，离心30 min (15000 g)，离心前对离心管称重。除去上清液，离心管烘干后称其重量，对已溶解样品的质量百分比与pH做曲线，分析待测样品的热稳定性。 1.3.10 数据平行测定38.0作图。 2 经过胃蛋白酶酶解20 min后得到的蛋胃蛋白 Maillard反应进程。 1.3.8 抗氧化性的测定 1.3.8.1 DPPH自由基清除能力测定 DPPH自由基清除能力测定参考Yen等方法，并加以改进。样品溶于蒸馏水中，蛋白浓度1 mg/mL(反应液20倍稀释)。向400 L加入2 mL 0.
11、12 mM DPPH母液（溶于4 保存），完全混合后在35 min，测定反应液517 nm处吸光度A白。 DPPH 自由基清除能力/?(1?)?100注：A0A1 1.3.8.2 参考1.25 mL pH6.61 mL和1.25 mL 1%20 min，迅速冷却后加入3000 r/min离心10 min，加2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%氯化铁溶液，10 min，在700 nm处测定吸光值。 1.3.8.3 OH自由基清除能力的测定 H2O2和Fe混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的羟自由基，其能被邻二氮哚菲有效的捕捉，并生成有色物质，但若加入具有清除作用的物质，便会与邻
12、二氮哚菲竞争，从而使有色产物生成量减少。用50 mM磷酸盐缓冲液配制含有0.75 mmo1/L的邻二氮哚菲和FeSO4溶液（pH 7.4）,用其配制不同浓度梯 28 2+ 图1 不同反应时间的接枝度 Fig.1 The degree of graft at different reaction time 如图所示，反应开始后，Maillard反应开始缓慢进行，接枝度逐渐升高，速率较快，反应3 h之后，Maillard反应较为充分，接枝度提高得非常明显，反应4 h之后，体系游离氨基数量减少，Maillard反应速度减缓，而且体系内肽链在热作用下容易发生聚集，表现为接枝度降低。综合考虑，选取反应时
13、间为4 h。 2.2 SDS-PAGE电泳图谱分析 电泳图谱用来鉴定蛋白-多糖共价复合物的形成 1113 。分离胶顶部多分散性条带的形成表明高分子量 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.2 物质的形成，通过多分散性的蛋白条带与糖染色条带一致来说明蛋白与多糖之间发生了共价交联。 响，特别是在等电点附近。这可能是因为SDC的空间结构更加稳定，不易受pH的影响，而HDC是蛋白质经过酶解后的生成肽链与多糖的交联，空间结构不稳定，容易受pH的影响。 图3 HDC、SDC 2.4 图2 考马斯亮蓝染色和PAS染色的SDS-P
14、AGE图谱 Fig.2 SDS-PAGE with coomassic brilliant blue staining and PAS staining 注：a 考马斯亮蓝染色图谱；b 为PAS，2-1 h，3-2 h，4-3 ，5-4 h。 图2时间的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图，1到条带5PAS染色，生成的5中，反应4 h后，糖2.1中的接枝度的分析。 图4 不同大豆水解蛋白最佳产物和SPI热稳定性比较 Fig.4 The thermal stability of HDC, SDC and Soy Hydrogent Protein 图4为HDC、大豆水解蛋白和SPI热稳定性比较，由图
15、4可知，经过Maillard反应的HDC在温度3080 都能保持几乎完全溶解，该复合物在温度90 时的溶解度仍能保持90%溶解性，说明产物热稳定性很高；对比大豆水解蛋白和SPI,可以明显地看到，大豆水解蛋白在温度80 时，溶解性开始下降，当到90 时，溶解性显著下降，这说明：酶解可以促进蛋白的溶解，但热稳定性较差，糖链可以提高肽链的热稳定性。 2.3 图3为HDC、大豆分离蛋白-葡聚糖共价复合物（SDC）和大豆水解蛋白的溶解性分析，通过实验结果可以发现，经过胃蛋白酶适度酶解再接枝后，HDC的溶解性较大豆水解蛋白有所提高，原因是带电的氨基酸残基的静电推斥和水合作用促进了蛋白质的溶解，同时，糖链也
16、在一定程度上促进蛋白的溶解。但是，HDC的溶解稳定性较SDC差，容易受pH的影 2.5 抗氧化性分析 图5a是HDC及其对照样的DPPH自由基清除情况分析，如图所示，HDC的清除率与大豆水解蛋白和它与葡聚糖的混合物相比明显升高，达到了66.39%。食物的抗氧化能力，主要取决于食物中的抗氧化物含量，可见，通过糖基化，产物中抗氧化物含量大大提 29 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.2 高，从而抗氧化能力得到加强。 图5b是HDC还原力的分析，如图所示，HDC还原能力最强，这表明：HDC可以作为氢供体与活性氧自由基
17、反应使其转化为稳定产物，从而阻断自由基链式反应，起到抗氧化作用。 图5c是样品羟自由基清除情况分析。如图所示，随着样品浓度的升高, 羟自由基清除率逐渐提高。与对照维生素C做对比，HDC的羟自由基清除率一直高于维生素C，当两者浓度达到10 mg/mL时，HDC的羟自由基清除能力与其相当，这表明HDC有较强的抗氧化力。 d43呈现相反的趋势，这主要是由于较小的乳化液滴使乳化液的透光率下降，从而体现出较高的乳化活性。由图6可知，与大豆水解蛋白、大豆水解蛋白-葡聚糖1:1混合物相对比，HDC的乳液粒径较小，而且长时间放置粒径变化不明显，说明其乳化稳定性较强，而大豆水解蛋白与葡聚糖的混合物稳定性较差，单
18、独加热4 h后的大豆水解蛋白乳化性最差，较长时间放置后发生明显的分层。该现象证明了酶法和Maillard反 6 /葡聚糖混合物和HDC的乳 化活性分析 本文采用胃蛋白酶对大豆分离蛋白进行适度酶蛋白-葡聚糖共价复合物，并对其性质进行了研究，结果表明： 3.1 大豆分离蛋白通过适度酶解得到蛋白肽有利于促进糖基化反应，缩短反应时间，在大分子拥挤环境下，大豆水解蛋白-葡聚糖比例为1:1反应4 h得到的最佳产物接枝度达38.05%。 3.2 通过对共价复合物的理化性质进行分析，探讨了多糖的键入对水解蛋白溶解性、热稳定性、抗氧化性和乳化性的影响，其中抗氧化性和乳化性提高显著。 3.3 通过蛋白的适度酶解，
19、有效地打开了蛋白大分子的三级空间结构，同时将蛋白的长肽链切断成中长链， 图5 各样品的抗氧化性分析对比 Fig.5 Oxidation resistance analysis of HDC 使更多的-氨基基团有机会与多糖的还原性羰基末端结合，从而进一步有效地进行蛋白与多糖的共价接枝反应，大大缩短了反应时间，并且得到的糖肽功能性优越性很明显。 2.6 乳化活性分析 图6为大豆水解蛋白、大豆水解蛋白-葡聚糖1:1混合物和HDC的乳化活性分析。粒径的大小关系到乳液乳化活性的高低，乳化活性与乳化液滴平均粒径 30 参考文献 1 Diftis N, Kiosseoglou V. Stability ag
20、ainst heat-induced aggregation of emulsions prepared with a dry-heated soy 现代食品科技 Modern Food Science and Technology Technology, 2007, 40(6): 955-962 2015, Vol.31, No.2 protein isolate-dextran mixture J. Food Hydrocolloids, 2006, 20(6): 787-792 2 Zhu D, Damodaran S, Lucey J A. Formation of whey prot
21、ein isolate (WPI)-dextran conjugates in aqueous solutions J. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(16): 7113-7118 3 Rialdi G, Battistel E. Thermodynamics of proteins in unusual environments J. Biophysical Chemistry, 2007, 126(1): 65-79 4 Sasahara K, McPhie P, Minton A P. Effect of dex
22、tran on protein stability and conformation attributed to macromolecular crowding J. Journal of Molecular Biology, 2003, 326(4): 1227-1237 5 Eggers D K, Valentine J S. Molecular confinement influences protein structure and enhances thermal protein stability J. Protein Science, 2001, 10(2): 250-261 6
23、张麟,卢滇楠,刘铮.高分子抑制蛋白质聚集的动态 Monte Carlo模拟J.化工学报,2008,59(1):153-159 ZHANG Lin, LU Dian-nan, LIU Zheng. Dynamic monte carlo simulation of inhibiting protein aggregation by polymer J. Journal of Chemical Industry and Engineering China, 2008, 59(1): 153 7 Bae S H, mulberry cultivars in Korea J. 8 Laemmli U
24、K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 J. Nature, 1970, 227(5259): 680-685 9 Kato A, Shimokawa K, Kobayashi K. Improvement of the functional properties of insoluble gluten by pronase digestion followed by dextran conjugation J. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1991, 39(6): 1053-1056 10 and 783-791 11 Kato A, Mifuru N, et Functional by controlled dry Biotechnology and Diftis N, V. Physicochemical properties of mixtures J. Food soy conjugates J. Langmuir, 2009, 31