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1、小檗碱对金黄色葡萄球菌诱导的ECV304细胞凋亡相关发展的路径R856.2 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）08-0003-02小檗碱又名黄连素，是一种具有悠久药用历史的异喹啉类生物碱，临床长期用于抗肠道细菌感染【1】。研究表明，小檗碱能改善炎症细胞因子诱导的肠上皮细胞内质网压力，下调细胞内JNK的磷酸化及caspase-12和caspsae-3水平，从而抑制炎症细胞因子诱导的细胞凋亡【2】。金黄色葡萄球菌可以感染并诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡【3】，在机体内，细胞凋亡有利于细菌侵入及毒素的扩散，从而引起组织损伤，抑制细胞凋亡对感染性疾病的控制具有一定意义。本实验的
2、目的是了解小檗碱是否可以调节S.aureus感染的ECV-304细胞内凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达，为治疗其感染提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和细胞系：S.aureu标准菌株ATCC25923由本实验室常规保存，培养基为哥伦比亚血琼脂平板（梅里埃）及LB培养基（Oxoid）。ECV-304由四川大学华西基础与法医学院微生物教研室保存并提供，细胞培养基为RPMI1640（Hyclone）。1.1.2 主要试剂：盐酸小檗碱购自本院药房（康和药业），RPMI1640培养基和胎牛血清（Hyclone），TRIzol试剂（Invitrogen），反转
3、录试剂盒（Fermentas），PVDF膜（millipore），细胞裂解液和ECL试剂盒（Beyotime），一抗及羊抗兔IgG（Boster）。1.2 方法1.2.1 药物原液的配制及保存：称取盐酸小檗碱，用无菌去离子水配制成2048μg/mL的药液，0.22μm滤膜过滤除菌后分装于灭菌的EP管中，置-20冰箱保存备用。1.2.2 细菌和细胞培养：将甘油保存的标准菌株转种血琼脂平板，37过夜培养，取单菌落接种于3mlLB液体培养基，置37恒温培养箱，200rpm振荡过夜，至细菌生长平台期。ECV-304用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，在37，5%CO2条件下常规培养
4、。1.2.3 小檗碱预处理S.aureu感染ECV-304细胞：LB过夜培养的细菌离心集菌，然后无菌PBS洗3次，用不含双抗的RPMI1640培养液重悬备用。胰蛋白酶消化ECV-304，无菌PBS漂洗3次后用不含抗生素的RPMI1640重悬，接种12孔板，37放置30min。实验分对照组（C），BBR组，S.aureus组及BBR+S.aureus共四组。BBR组和BBR+S.aureus组孔内分别加128μg/mL的BBR预处理2h后，每孔按照细胞：细菌=1：100的比例将细菌悬液加入相应孔内，37培养24h。1.2.4 细胞总RNA提取：采用TRIzol一步法提取细胞总RNA，用DE
5、PC处理水20μl溶解RNA。1.2.5 反转录及PCR扩增：按照反转录试剂盒说明书上的操作将提取的总RNA反转录为cDNA，用cDNA作为模板PCR扩增相关基因，基因引物序列及扩增片段大小见表1，引物合成由上海Invitrogen公司完成。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测并在紫外灯下观察拍照。以GAPDH为内参，BandScan软件分析各个条带的光密度值，计算各组细胞因子mRNA表达相对值（目的基因/内参基因）。1.2.6 WB检测凋亡相关蛋白表达：每孔加入100μl0.25%胰酶，37消化5min后加入1ml完全培养基终止消化，吹下细胞并分别收集于1.5mlEP管，40
6、00rpm5min离心，弃上清收集细胞。加入150μl细胞裂解液及2μlPMSF，于冰上反复吹打2min，将EP管置于冰上，每5min振荡一次共30min使细胞充分裂解，4，12000rpm离心15min，上清为总的细胞蛋白溶解成分。按常规方法进行SDS-PAGE，分离胶12%，浓缩胶5%，电泳时间1.5h。350mA恒流电泳90min转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉中4封闭过夜，然后用1xTBST漂洗3次，封闭后的膜放入杂交袋中，加入1：200稀释的一抗于袋内，4过夜，TBST漂洗3次加PBS1：5000稀释的羊抗兔IgG二抗，置37孵育1h，TBST振荡洗膜3次，每次10min。
7、ECL方法显色后用BIO-RAD凝胶成像仪检测蛋白并拍照。以β-actin蛋白为内参，BandScan软件分析条带的光密度值，计算各组细胞因子蛋白的相对表达量（目的蛋白/内参蛋白）。1.2.7 统计学分析：所有实验均重复3次，各组数据采用X±s表示，结果用SPSS16.0统计软件中的2 结果2.1 凋亡相关细胞因子mRNA水平改变：电泳结果用BandScan软件进行灰度分析，计算各组细胞因子mRNA表达相对值（目的基因/内参基因）。结果表明S.aureus的感染导致Bcl-2、Bax和caspase-3mRNA表达与正常对照组相比较有显著性差异（p0.05），感染S.a
8、ureus的细胞抗凋亡因子Bcl-2表达显著性下降，而促凋亡细胞因子Bax和caspase-3表达量显著性增加。用BBR处理后再感染S.aureus发现，与S.aureus组比较，Bcl-2的表达量显著性上升而Bax和caspase-3表达量显著性下降（p0.05，图1）。*p0.05与对照组（C）相比，*p0.05与S.aureus组相比2.2 凋亡相关细胞因子蛋白水平改变：BandScan软件分析WesternBlot条带的光密度值，计算各组细胞因子蛋白的相对表达量（目的蛋白/内参蛋白），结果显示，S.aureus的感染导致Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达量与正常对照组相比较
9、有显著性差异（p0.05，图2），用BBR处理后再感染S.aureus发现，Bcl-2蛋白表达量与S.aureus组比较显著性上升而Bax和caspase-3蛋白表达量显著性下降。3 讨论细胞凋亡是有核细胞在凋亡刺激信号作用下通过启动细胞内死亡机制，经过一系列信号转导途径，最终发生细胞程序性变性和死亡的过程。细胞在凋亡的过程中，凋亡基因对细胞凋亡的发生起重要作用，其中Bcl-2家族中Bcl-2和Bax基因分别是代表性的抑制凋亡和促进凋亡的基因，且Bax是Bcl-2活性的主要调控因子【4】。半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，其中Caspase-3被称为死亡蛋
10、白酶;，一旦被激活，凋亡不可避免【5】。我们的研究结果显示，当用BBR预处理细胞后再用S.aureus感染，细胞内抗凋亡因子Bcl-2表达上升，而促凋亡因子Bax和Caspase-3表达量下降。Bcl-2具有保护细胞的功能，该结果表明小檗碱可以通过调节凋亡相关因子Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达来保护S.aureus诱导的ECV-304细胞凋亡。S.aureus是医院感染和社区感染的重要病原菌之一，近年来由于抗生素的广泛使用导致大量耐药菌株的产生，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现使该菌感染的治疗变得更为困难【6】。MRSA治疗难度大，病死率高，尤其是对万古霉素耐药的
11、金黄色葡萄球菌（VRSA）的出现使得抗生素的选择尤为谨慎，新的治疗药物的研究及开发迫在眉睫。小檗碱又名黄连素，是一种具有悠久药用历史的异喹啉类生物碱，作为清热解毒药和抗菌药在临床上已应用多年。研究发现，小檗碱能通过干扰细菌代谢及DNA合成等途径发挥抗菌作用，并且其可增加MRSA对β-内酰胺类抗生素的敏感性，两者联用对MRSA有协同抗菌作用。本实验结果表明，作为传统抗炎、抗菌中药成分的BBR还可能通过抑制S.aureus诱导的细胞凋亡而起到抗菌作用，这可能是BBR对S.aureus引起的感染具有一定疗效的机理之一。本研究我们采用S.aureus感染ECV-304为体外感染模型，检测感染
12、细胞及BBR预处理细胞内凋亡相关基因的mRNA及蛋白表达水平的变化，了解BBR抗S.aureus感染的机理。结果表明BBR通过调节凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达来抑制S.aureus诱导的ECV-304细胞凋亡。本实验结果为以后找到一种理想、有效而不会产生耐药性的预防及治疗S.aureus感染的中药成分提供实验依据，为形成具有我国特色的用中药防治感染性疾病的体系提供支持。参考文献【1】 郝钰，徐泊文，郑宏，等.小檗碱对人脐静脉内皮细胞增殖与凋亡的作用.中国病理生理杂志，2005，21（6）：1124-1127。【2】 HaoXH，YaoAL，GongJF，etal.BerberineAmelioratesPro-inflammatoryCytokine-InducedEndoplasmicReticulumStressinHumanIntestinalEpithelialCellsInVitro.Inflammation，2012，35（3）：841-849.【3】 熊传银，罗庆华，胡汉斌，等.金黄色葡萄球菌诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的观察.热带医学杂志，2013，13（5）.【4】 吉木斯，李存保.Bcl-2家族在线粒体细胞凋亡途径中的作用.内蒙古医科大学学报，2013，35（2）：152-157.