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1、文蛤弧菌抗性相关基因表达性状的分析及其遗传力估计文蛤 (Meretrix petechialis)是我国重要的经济养殖贝类之一。近年来, 养殖过程中时有弧菌病和规模性死亡的发生, 给文蛤养殖业带来了沉重的打击。这固然与养殖环境恶化、养殖密度增加等因素有关, 但抗性优良品种的缺乏也是造成上述问题的重要原因。因此, 通过遗传选育的方式培育抗病、抗逆的文蛤新品系具有重要的经济价值。然而 , 由于抗病性的遗传机制非常复杂, 受环境影响较大以及抗性性状难以准确测量等原因 , 使得贝类抗性选育工作的进程十分缓慢。在抗性选育中 , 遗传参数的准确估计是制定有效选育策略的前提和基础, 而与弧菌抗性显著相关的分
2、子标记的应用 , 可以加速抗性品系的培育进程。本研究通过建立的具有抗性差异的全同胞家系材料, 基于文蛤的转录组测序数据 , 对文蛤的弧菌抗性和免疫基因的表达性状进行了关联分析, 并估计了基因表达性状的遗传参数 , 研究结果将有助于指导文蛤的弧菌抗性选育工作。本研究的主要结果如下 :1 、本研究采用 RNA-seq技术检测了文蛤感染弧菌后的肝胰腺中的基因表达变化。Illumina测序共获得了199,318,966 条 clean reads,进一步拼接得到214,577 条转录本 , 其中 ,N50 长度为 1393 bp 的 147,255 条 unigenes 用于后续分析。经过 GO分析共
3、得到 21 个生物学过程亚类、 15 个细胞组分亚类和12 个分子功能亚类。KEGG分析发现有 8,358 条 unigenes 映射到 267 个生物信号通路 , 其中有 16个信号通路与免疫系统相关。通过差异表达分析, 共得到 206 个差异表达基因(DEGs), 包括 113 个上调的 DEGs和 93 个下调的 DEGs。在这些 DEGs中, 至少在一个数据库中有注释的基因为96 个, 注释率为46.60%。为了验证转录组数据的可靠性, 选取了 15 个 DEGs进行 qRT-PCR分析 ,结果表明有 13 个基因的表达模式与转录组分析的结果一致。在 206 个 DEGs中, 有 14
4、 个被注释为与免疫相关的基因 , 我们进一步检测了其中 4 个基因 (BIRC7、HSF、C1ql4 和 C1ql) 在文蛤浸泡攻毒后的表达模式。 这些研究结果丰富了文蛤的转录组数据库 , 并为研究文蛤感染弧菌后的免疫反应提供了基础数据。2、基于基因表达数据 , 筛选了可用于指示文蛤抗性表型的相关标记。 实验选取 23 个全同胞家系的 1772 只文蛤进行弧菌感染实验 , 结果表明不同家系间存在显著的弧菌病抗性差异。从表型稳定的抗性家系与敏感家系中各选取3 个家系 , 用于抗性相关标记的筛选。对 22 个免疫相关基因进行弧菌感染分析, 结果显示其中 12 个基因的表达水平在弧菌刺激后呈显著变化
5、。进一步将这 12 个基因分别在 3 个抗性与 3 个敏感家系进行攻毒前后的表达定量分析 ,t 检验和线性回归分析结果发现, 在未攻毒的家系中有5 个基因的基础表达水平与弧菌抗性具有显著相关性, 分别为 Big-Def 、BIRC7、 NFIL3、CTL9和Bax, 表明其可作为抗性相关的候选标记。 进一步选取了两个抗性不同的文蛤品系进行验证 , 结果证实了 BIRC7和 NFIL3 的基础表达水平与弧菌抗性表型相关。本研究还监测了文蛤在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)攻毒过程中体内病原菌含量的动态变化, 结果发现 , 浸泡感染 24 h 后, 文蛤肝胰腺内的副溶血
6、弧菌载量达到了极高水平, 随后载菌量开始下降 , 到第 3 d 后一直维持在一个较低的水平。我们对高、低载菌量组中的抗性相关基因的表达水平进行了分析, 发现抗性相关基因在高载菌量组中的表达水平显著高于低载菌量组。本研究整合了弧菌抗性表型、基因表达数据和载菌量以用于抗性评价, 为文蛤弧菌高抗品系的遗传选育提供了可靠的分子标记。3、采用部分因子设计构建全同胞家系估计文蛤免疫相关基因表达性状的遗传参数和遗传力。研究选取了 5 个弧菌抗性相关基因 (Big-Def 、BIRC7、 NFIL3、CTL9和 Bax)在文蛤肝胰腺样品中进行基因表达分析, 结果显示所有基因表达数据均呈正态分布 (P>0
7、.05) 。经亲本模型估计 , 文蛤中免疫相关的基因表达性状存在显著的加性效应。在这 5 个基因的表达性状中 , 有 2 个基因的表达性状 (Big-Def 和 CTL9)表现出显著的父本效应 , 但所有 5 个基因表达性状都没有表现出显著的母本效应。5个基因表达性状的遗传力分布在0.113-0.530不等。同时 , 在每个基因的表达性状和生长性状之间没有检测到显著的表型相关和遗传相关。此外 , 选取了 F1 代家系中的抗性家系No.47 和 No.60 构建了 F2 代家系 , 弧菌感染实验表明 ,F2 代的弧菌抗性显著提高 , 感染后的存活率较 F1 代提高了 10%-15%,获得了良好的抗性遗传进展。上述研究表明 , 基因表达变异是可遗传的 , 并且与之相关的抗性性状也可以通过遗传选育得到改良。因此 , 抗性相关基因表达标记的开发为文蛤弧菌高抗品系的间接选育提供了参考。