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1、放射免疫显像在评价结直肠癌干细胞标志抗原CD133表达中的初步研究目的本研究中检测了不同结肠癌细胞系中CD133和 CD44两种标志物的表达情况 ; 在体外研究中分析 , 不同细胞对 1311 标记的 CD133特异性抗体 -AC133.1 mAb 的摄取差异 ; 并在荷瘤裸鼠体内研究标记抗体靶向性识别CD133阳性肿瘤细胞的能力 , 探索放射免疫显像在体示踪肿瘤干细胞的可行性 , 并为结直肠癌的放射免疫治疗提供实验依据。方法 1. 选用三种结直肠癌细胞系 HT29、HCT116和 DLD-1,采用流式细胞术和 Western-blot 分析检测其中 CD133和 CD44分子的表达情况。 2
2、. 将三种细胞进行 Transwell 侵袭实验研究 , 分析细胞侵袭性与CD133和 CD44分子的表达情况之间的相关性。 3. 用 1311 标记 CD133分子的特异性单克隆抗体AC133.1mAb,将标记物使用 PD-10 脱盐柱进行纯化 , 并检测标记抗体的标记率、放化纯及稳定性。4. 对上述三种细胞进行标记抗体 131I-AC133mAb体外细胞摄取实验 , 分析细胞摄取水平与 CD133分子的表达情况间的关系。 5. 建立三种细胞的荷瘤裸鼠模型 , 同时分别设立实验组和阻断组 , 分别于尾静脉注射标记抗体 , 在不同时间点对其进行 SPECT/CT断层显像及生物学分布实验 , 分
3、析标记抗体在体内的代谢特点。 6. 对组织 / 器官的冰冻切片进行免疫荧光检测分析和放射自显影研究, 分析体内标记抗体的分布与抗原CD133表达情况间的关系。结果1. 结肠癌细胞系 HT29、HCT116细胞中 CD133分子的表达水平分别为 91.33 1.66%、90.83 2.47%, 明显高于 DLD-1细胞中 CD133分子的表达水平 3.87 0.57%(P<0.01);而 HT29、HCT116 和 DLD-1 细胞中 CD44 表达水平分别为 24.53 8.35%、6.0 0.82%和 8.87 3.9%。细胞 Western-blot分析结果显示 :HT29、HCT1
4、16细胞高表达 CD133,而 DLD-1细胞表达量较低 ; 而 HT29细胞中 CD44表达较 HCT116和 DLD-1细胞中 CD44表达高。 2. 三种细胞 Transwell 实验结果显示 ,HT29 细胞和 HCT116细胞穿过的细胞量较多 ,DLD-1 细胞仅有少量明显细胞穿过。 3. 标记后的 131I-AC133mAb的标记率为 68.37 2.45%, 纯化后 , 标记抗体的放射性化学纯度为91.18 3.41%,且在体外具有较好的稳定性。标记抗体的体外细胞摄取研究结果显示 :HT29 和 HCT116细胞对 131I-AC133 mAb的摄取在 4h达高峰 , 分别为 2
5、9.63 3.92%和 33.99 6.65%, 其未标记抗体阻断组的摄取率分别为3.22 0.18%和 3.67 0.56%; 实验组与阻断组间存在显著统计学差异 (P<0.01); 而 DLD-1细胞对 131I-AC133 mAb 的摄取始终较缓慢 , 在 4h 时摄取率仅为 2.89 0.90%,显著低于 HT29和HCT116细胞 4h 的摄取率 (P<0.01) 。4. 从 SPECT/CT显像结果和生物分布研究结果来看 , 荷 HT29和 HCT116肿瘤鼠在注射 131I-AC133 mAb后 7 天的放射性摄取最高 , 肿瘤组织的克组织百分摄取率分别为5.49 0
6、.42%ID/g 和 5.04 0.05%ID/g, 明显高于荷 DLD-1肿瘤鼠1.20 0.11%ID/g(P<0.05);相应的肿瘤与肌肉比值 (T/M) 分别为11.34 0.09,11.31 1.05 和 3.43 0.53 。不同肿瘤组织中标记抗体的放射性分布与免疫荧光分析间保持了较好的一致性。5. 在阻断组实验中 , 各时间点肿瘤组织均未见明显的放射性浓聚, 且肿瘤组织的放射性生物分布明显低于实验组, 注射标记抗体第7 天时 , 荷 HT29和HCT116肿瘤鼠的移植瘤阻断组的生物分布分别为2.18 0.38%ID/g(n=4),2.060.35%ID/g(n=4) 。6.
7、 组织 / 器官的冰冻切片进行免疫荧光检测分析和放射自显影研究显示: 体内标记抗体的放射性分布与抗原 CD133表达情况相一致。结论结肠癌细胞系 HT29和 HCT116细胞中 CD133表达较 DLD-1 细胞高 ,HT29 细胞中 CD44分子表达水平较 HCT116和 DLD-1细胞高 ; 体外细胞摄取实验、 SPECT/CT断层显像、生物分布和放射自显影研究都体现了这一差异性 , 且其中 CD133的靶向抗体 131I-AC133 mAb对该抗原有较好的特异性 , 显示出以131I-AC133 mAb为分子探针的放射免疫显像在评价CD133阳性肿瘤细胞的表达水平及分布情况的可行性, 为肿瘤干细胞的放射免疫显像和放射免疫治疗提供了实验依据。