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1、牡丹籽油抗炎作用的分子机理研究牡丹籽油 (peony seed oil,PSO)属于新食品资源 , 被专家评为优质食用油 ,是从牡丹籽中提炼的金黄色透明液态油。不饱和脂肪酸是PSO中最重要的活性成分 , 其中亚麻酸的含量所占比例为60%。研究表明 PSO具有许多生理功能 , 最近研究显示 PSO可能具有抗炎生物活性 ,但其具体抗炎功能分子机制尚无文献报道。本实验研究利用细胞和动物炎症模型:葡聚糖硫酸钠 (sodium dextran sulfate,DSS)诱导 ICR 小鼠构建体内炎症模型和脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)刺激 RAW264.7巨噬细胞构成体外炎症模型
2、,共同对 PSO抗炎功能进行评估及对抗炎作用的分子机理进行初步探究。实验结果为牡丹籽深加工及牡丹籽油保健食品的开发提供参考。实验观察发现 :PSO干预组小鼠比 DSS组精神状态明显好转 , 便稀、便血小鼠数量减少或无,结直肠病变程度减轻 , 疾病活动指数 (disease activity index,DAI)评分降低趋势显著。使用苏木精 - 伊红染色法 (hematoxylineosin staining,H&E)检测小鼠结肠组织病变情况 , 显微镜下采集图片分析比较可知,DSS组小鼠病变情况如下 : 黏膜大面积糜烂 , 腺体隐窝结构完整性破坏较严重, 有大量的炎性细胞如淋巴细胞及伴中性粒细
3、胞等浸润 , 杯状细胞数量显著减少 , 呈现出溃疡性结肠炎症状; 而 PSO干预组小鼠结肠出血较少, 炎性细胞有少量浸润 , 结肠黏膜糜烂状况减轻 , 隐窝结构排列较为整齐、 形态较为完整。通过测定小鼠血浆中组织损伤因子髓过氧化物酶 (myeloperoxidase,MPO) 、丙二醛 (malondialdehyde,MDA), 发现 DSS组中 MPO和 MDA和分别升高为对照组的3.5 和 3.2 倍。同时也发现小鼠结肠组织损伤炎症介质一氧化氮(nitrite/nitrate,NO)含量升高了 4.2 倍 ; 相比于 DSS组,PSO组 MPO、MDA和 NO含量分别降低了20%、26%
4、和 22%。从生化指标的角度 , 发现 PSO能减少 DSS诱导的小鼠损伤。荧光实时定量 PCR技术 (real time-quantitative polymerase chainreaction,RT-qPCR) 和蛋白质免疫印迹技术(westernblotting,WB)检测发现 , 与对照组相比 ,DSS组小鼠结肠组织中环氧化合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、肿瘤坏死因子 - (tumor necrosis factor- ,TNF- ) 、白细胞介素 -1 (interleukin-l,IL-1 ) 和诱导型一氧化氮合酶 (inducible nitric o
5、xidesynthase,iNOS) 的 mRNA表达水平显著升高 , 而 PSO组相比于 DSS组分别下降53.6%、41.0%、 50.6%和 54.2%。WB实验进一步证实了这些炎性细胞因子蛋白质表达水平有相似结果。检测结肠组织中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases,MAPKs) 信号通路关键靶基因的磷酸化表达情况。DSS组细胞外调节蛋白激酶 1/2的磷酸化 (phosphorylation of extracellular regulated proteinkinases1/2 、p-ERK1/2) 、c-Jun氨基末端激酶的磷酸化 (p
6、hosphorylation ofc-Jun N-terminal kinase,p-JNK)和 p-p38 蛋白质表达量为对照组的1.48 0.23 、1.88 0.24 、3.21 0.45 倍。PSO组分别为对照组的1.23 0.15 、1.45 0.25 和 1.48 0.34 倍。结果显示 PSO能抑制 MAPK信号通路的活化 , 可能与其抑制炎症因子表达相关。体外实验中通过噻唑兰 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTS) 法检测 PSO对 RAW264.7细胞毒性影响。 结果显示PSO各组与对
7、照组 OD值无明显差异。说明 0400g/mLPSO溶液对 RAW264.7细胞的生长、状态及活力无影响,证明对细胞无毒性 , 可用于后续实验研究。 LPS组细胞 COX-2、TNF-、IL-1 和iNOS炎症因子 mRNA表达量为对照组的5.66 、7.59 、6.78 和 2.62 倍; 而 PSO25 g/mL、50 g/mL 和 100 g/mL 三组与 LPS组相比 , 均呈剂量依赖性显著降低。蛋白表达量有相似结果。 采用荧光素酶报告基因技术检测炎性细胞中炎症相关的核转录因子转录活性。相比于对照组 ,LPS 模型组细胞 AP-1/c-Jun(activatorprotein-1)与
8、NF-B/p65(nucleartranscriptionfactor-B)相对荧光素酶活性 (RLU)分别增加了1.89 倍和 2.22 倍, 而 PSO各组细胞中 AP-1 与 NF-B 的 RLU值呈剂量依赖性减少 , 分别减少了 32.3% 、39.2%、 47.1%和 36.9%、43.7%、 55.4%。c-Jun 和 p65蛋白在胞浆与胞核中的变化情况如下: 相比于对照组 ,LPS 组胞核与胞浆中c-Jun和 p65 蛋白表达量趋势相反 , 在胞核中均增加 , 而胞浆中均下降 ; 相比于 LPS组细胞 ,PSO组胞核中和胞浆中 c-Jun 蛋白表达量逐渐增加 , 而 p65 蛋白
9、表达量显著降低 , 且呈剂量依赖性。因此 ,PSO可显著抑制炎症细胞胞浆胞核中c-Jun 、p65 的移位作用 , 可使 AP-1、NF- B 转录活性降低。对细胞中MAPKs通路关键靶基因的磷酸化激活水平的检测 , 结果表明 PSO组 p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 蛋白表达量相比 LPS组下降 , 说明PSO可能通过调节 MAPKs关键靶基因磷酸化的激活抑制炎症的产生。LPS诱导的 RAW264.7细胞中 , 加入 MAPKs通路靶基因的抑制剂处理, 利用 WB技术检测各组细胞中促炎因子IL-1 表达量 , 以及 MAPKs关键靶基因的磷酸化激活情况。由结果可知 , 与 LPS诱
10、导组相比 , 在 PSO与 MAPKs抑制剂共同作用下 , 细胞中炎症因子 IL-1 表达水平及 MAPKs关键靶基因中 p-ERK1/2、 p-JNK、p-p38的蛋白表达水平显著减少。说明在 MAPK磷酸化作用被阻断的情况下,PSO可与抑制剂发生协同作用抑制炎症因子的表达从而发挥抗炎功效。综上所述可知 , 在体内实验中 , 从动物整体水平上 PSO能有效改善 DSS诱导小鼠结肠炎症的宏观表型, 降低 DAI, 缓解结肠组织病理损伤 ; 降低结肠组织中MPO、MDA含量和血清中 NO含量 ; 抑制结肠组织中COX-2、TNF-、 IL-1 和 iNOS等促炎基因的高表达 ; 减少结肠组织中p
11、38、JNK及 ERK1/2的磷酸化水平。在体外实验中 , 从细胞整体水平上PSO可下调 LPS诱导的 RAW264.7细胞炎症因子 COX-2、TNF-、 IL-1 和 iNOS基因的过表达 ; 抑制炎症相关转录因子 ( 如NF- B、 AP-1) 在胞浆胞核间的变化情况及转录活性; 减少 MAPKs中 p38、JNK及ERK1/2的磷酸化程度。另外 , 在 PSO存在的情况下 , 添加 MAPKs抑制剂可进一步抑制 MAPKs中 p38、 JNK及 ERK1/2磷酸化水平以及炎症因子IL-1 的表达。提示 PSO抗炎机理的分子机制 , 与通过抑制结肠组织和细胞中MAPKs信号通路 , 以及抑制细胞中核转录因子从而减少炎症因子的表达有关。