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1、高碘酸氧化和 Smith降解原理：高碘酸 氧化和 Smith 降解高碘酸可 性断裂糖分子中的 二 基或 三 基 处 ,生成相 的多糖 ,甲 或甲酸 .反 定量 行 ,每开裂 1 个 C C 消耗 1 分子高碘酸 .通 定高碘酸的消耗量及 甲酸的 放量 ,可以判断 糖苷 的位置 ,直 多糖的 聚合度 ,分支多糖的分 支数等 .Smith 降解是将高碘酸 氧化 物 原后酸水解 ,再 定水解 物 ,从而推断 糖苷 的位置与分 支点等.以葡萄糖 例 ,以 1 2 或 1 4 位 合的糖基 高碘酸氧化 ,平均每个糖基消耗 1 分子高碘酸 ,且无甲酸 放 ;1 3 位 合的糖基不被高碘酸氧化;1 6 位
2、合的糖基或非 原末端糖基 高碘酸氧化,消耗 2 分子高碘酸同 放1 分子甲酸 .准 物品：容量瓶（ 25ml * 2 ， 50ml * 2 ；茶色 好）、 、碱式滴定管、定量 ；高碘酸 、乙二醇、溴甲酚 (红)紫指示 、 0.005N NaOH( 由 0.1N NaOH 稀 20 倍制得，使用前用 苯二甲酸 定 )、NaBH 4 或 KBH4 、50% HAc 、1M H 2 SO4、 BaCO 3 、乙醇。 步 ：（1 ）准确配置 30mM NaIO4 50ml（320.8mg NaIO4 ，定容至 50ml ），用 包好避光，取 0.1ml 稀 至 25ml ，223nm 定吸光 大于 0
3、.6 方可使用。（注：此溶液必 用 配。 ）（2 ）准确称取糖 50mg （ 下准确 量），用少量水溶解于 50ml 容量瓶中，然后加入30 mM NaIO 4 25ml ，蒸 水定容，使 NaIO 4 度 15mM 。用 包好避光，放置在低温暗 反 ， 隔 (0 、6 、 12 、24 、36 、48 、60 小 )取 0.1ml ，用蒸 水稀 250 倍，以蒸 水作空白 照，在 223nm 波 光密度 ，直到光密度 恒定 止。（3 ）同 将剩余的 30mM NaIO4稀 15mM ，与反 品同 放置作 照， 待反 束 取出 0.1ml ，稀 250 倍后，用蒸 水按不同比例稀 ，每 度三个
4、重复， 定223nm 的光密度 ，以 OD 坐 ， NaIO 4 度 横坐 ，制作 准曲 。NaIO 4 浓 度03691215（Mm ）蒸 水（ ml ）543210NaIO 4 溶液（ ml ）012345（4 ）通 准曲 ， 算出高碘酸的消耗量。消耗高碘酸的量（mmol ） =( 反 前高碘酸 度 - 反 后高碘酸 度 )* 反 体 （5 ）取 2ml 上述氧化液，加 1 滴溴甲酚 (红)紫作指示 ，用 0.005N NaOH 溶液滴定， 算得甲酸生成量。甲酸生成量（ mmol ）= （NaOH 的准确 度 * 滴定用的体 /2ml ）*反 体 （6 ）加乙二醇 止高碘酸氧化反 。 流水
5、及蒸 水各透析24 小 。 至 10ml ，加入 KBH 470mg 原 夜。用 50%乙酸中和至 pH 为 6 7，流水及蒸 水各透析24 小 。取 1/3 干燥后做完全酸水解和GC 分析，剩余部分 行Smith 降解。1（2 ）加入等体积的 1M H 2SO4，25 水解 40 小时， BaCO 3 中和至 pH 为 6 ，用定量滤纸过滤，滤液用蒸馏水透析 8 小时，袋外部分干燥做 GC 分析，滤液再用流水蒸馏水各透析 24 小时，袋内部分水浴浓缩到适当体积，加乙醇醇析，离心，上清及沉淀部分干燥后分别做完全酸水解和 GC 分析。高碘酸氧化、 Smith降解实验原理 ：高碘酸氧化和 Smit
6、h 降解：高碘酸可选择性断裂糖分子中的邻二 羟基或邻三羟基处 ,生成相应的多糖醛 ,甲醛或甲酸 .反应定量进行 ,每开裂 1 个 C C 键消耗 1 分子高碘酸 .通过测定高碘酸的消耗量及 甲酸的释放量 ,可以判断 糖苷键的位置 ,直链多糖的 聚合度 ,分支多糖的分 支数等 .Smith 降解是将高碘酸 氧化产物 还原后酸水解 ,再鉴定水解产物 ,从而推断 糖苷键的位置与分 支点等.以葡萄糖为例 ,以 1 2 或 1 4 位键合的糖基经高碘酸氧化 ,平均每个糖基消耗 1 分子高碘酸 ,且无甲酸释放 ;1 3 位键合的糖基不被高碘酸氧化;1 6 位键合的糖基或非还原末端糖基经高碘酸氧化,消耗 2
7、 分子高碘酸同时释放1 分子甲酸 .。高碘酸氧化是一种选择性的氧化反应， 它只能作用于多糖分子中连二羟基或连三羟基处。 当连二羟基的 C-C 键被氧化断开后，产生相应的醛；当连三羟基的 C-C 键被氧化断开后，产生甲酸及相应的醛。此反应定量进行，每断开 1molC-C 键，消耗 1mol 高碘酸，每生成 1 mol 甲酸对应消耗 2mol 高碘酸。因此，通过测定高碘酸消耗量及甲酸生成量，便可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目等。高碘酸氧化产物经硼氢化钾还原，得到的多糖醇用稀酸在温和条件下水解，可发生特异性降解， 称为 Smith 降解。 Smith 降解的特点是只打断被高
8、碘酸破坏的糖苷键，而未被高碘酸氧化的糖残基仍连在糖链上。这样，多糖醇经 Smith 降解，就可以得到小分子的多元醇和未被破坏的多糖或寡糖片断，对这些产物进行分析，便可以推断出糖苷键的键型及其位置。下面以各种键型连接的葡聚糖为例，反应式如下：以1 2 或12,6 位糖苷键连接的葡聚糖反应式：CH OHCH 2OHCH 2OH2CH 2OHO-OOH +OHIO 4KBH 4OHCCH 2OH2 CHOHOHO.OHCO.HOH 2CO.O.O.O.CH 2OH以 1 或 1 6位糖苷键连接的葡聚糖反应式：2CH 2O.CH OHCH 2OHO2O+-OKBH 4HOHIO 4甘油 乙二醇O.CH
9、OCH2OHOHOHCO.H 2CO.OHHO+HCOOH以 1 4 或14,6 位糖苷键连接的葡聚糖反应式：CH 2OHCH OHCH 2 OHO2O-OKBH 4H+OHIO 4赤鲜醇 乙二醇O.O.CHO OHC O.O.O.OHO.CCH2H 2OHOH以 1 3 、13,6 、12,3 、12,4 、 1 3,4 、12,3,4 位糖苷键连接的葡聚糖反应式：CH 2OHCH 2OHOKBH 4H +OIO 4-O.OHOHO.OHOHOHOH由此可见：（ 1 ）1mol 1 或 16 位糖苷键连接的葡聚糖被高碘酸氧化时消耗 2 mol 高碘酸，生成 1 mol 甲酸；（ 2 ）1mol 1 2 或12,6 、1 4、14,6 位糖苷键连接的葡聚糖被高碘酸氧化时只消耗高碘酸，不生成甲酸；（ 3 ）不被高碘酸氧化的己糖残基糖苷键型为： 1 3、 1 3,6、 1 2,3 、1 2,4 、1 3,4 、 12,3,4 ；（ 4 ）产生甘油的己糖残基糖苷键型为： 1 、 16 、1 2、1 2,6 ；（ 5 ）产生赤藓醇的己糖残基糖苷键型为： 1 4、1 4,6 ；参考文献3