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1、,HLA分型技术,上海交通大学医学院 彭奕冰 主任技师,1,深层分析,Major Histocompatibility Complex(MHC),What is MHC? HLA H-2 Minor histocompatibility antigens,2,深层分析,Significance of the MHC,role in immune response role in organ transplantation role in predisposition to disease,3,深层分析,Progress in organ transplantation,4,深层分析,Genet
2、ic barriers to transplantation,autologous: in the same individual (autograft) isologous: between genetically Identical individuals (isograft), i.e., identical twins (inbred animals) homologous: between individuals of the same species (allograft) heterologous: between individuals different species (x
3、enograft),5,深层分析,Principles of transplantation,6,深层分析,Minor histocompatibility antigensand graft survival,minor histocompatibility antigens also cause rejection The rejection time is variable but longer than that for major histocompatibility antigen They have additive effects,7,深层分析,Graft versus hos
4、t (GVH) disease,8,深层分析,GVH disease in humans,9,深层分析,The human MHC genes,10,深层分析,The mouse MHC genes,11,深层分析,Polymorphism of MHC antigens (based on phenotype),HLA基因系统的多态性及一些主要基因座位的等位基因数 正式命名显示多态性的HLA基因座位有31个，共2 320个等位基因。 图中所示为常见基因座位的等位基因数。,12,深层分析,The inheritance of MHC genes,13,深层分析,Crossing overres
5、ults in new haplotypes,14,深层分析,MHC products expressed on cells,If Jack and Jill have four children; Bo, Kim, Mo and Lee Theyll all inherit antigens of the parental MHC Oft their haplotypes will be of the father or mother Unless during meiosis, a crossover should occur,15,深层分析,Class-I expressed on al
6、l nucleated cells in man, and also on erythrocytes in mice.,Class-II expressed primarily on antigen presenting cells (dendritic cells, macrophages and B cells, etc.),Differential expression of MHC antigens,16,深层分析,Alloreactivity of T cells: MLR and CTL generation,CD4+TH1,CD8+CTL,CD8+preCTL,17,深层分析,A
7、lloreactivity of T cells,Positive Selection,Thymus,Alloreaction (MLR),Proliferation and Differentiation,18,深层分析,Inflammation,lysis,ADCC,lysis,IL2, IFN ,TNF, NO2,IL2, IL4, IL5,IL2, TNF, IFN ,rejection,Mechanisms of graft rejection,19,深层分析,Tempo of rejection reaction,20,深层分析,A, B & DR matching and gra
8、ft survival,21,深层分析,Removal of T cells from marrow graft,Magnetic antibodies,22,深层分析,HLA and disease association,23,深层分析,HLA抗原检测法,24,深层分析,微量细胞毒试验,原理 当特异性抗体与淋巴细胞表面HLA分子结合，激活补体，使细胞溶解。在显微镜下可见细胞被活性染料着色。 淋巴细胞只表达HLA I分子，如欲测定HLA II类分子，需用细胞。,25,深层分析,微量细胞毒试验 HLA I类分型法,方法 加板：Terasaki板中加入特异性抗HLA I类分子抗体。 分离PBMC
9、。制成浓度为1106/ml的细胞悬液。 每孔内加入1l细胞悬液。 室温培育30min。 1 l兔补体。室温培育60min。 每孔内加入5l 5%伊红水溶液。室温5min。 每孔内加37%甲醛固定。 倒置相差显微镜下观察结果。,26,深层分析,微量细胞毒试验 HLA II类分型法,与HLA类分型法区别 1须用富含细胞的淋巴细胞悬液。 2抗体与细胞培育时间为1h。 3加补体后培育时间为2h。,27,深层分析,微量细胞毒试验,应用实践 个体HLA分型可用于移植前供者和受者配型，亲子鉴定，法医鉴定等。,28,深层分析,交叉配型,用于测定受者血清中受含有抗供者HLA的抗体。如受者血清中具有抗供者红细胞血
10、型抗原抗体和/或抗白细胞抗原抗体，会引起超急排异反应。所以移植前应作红细胞血型测定，以及测定患者血清中是否具有抗供者HLA抗体。,29,深层分析,交叉配型,方法 1. 分离供体PBMC。 2. 分离受者血清，作1：2，1：4和1：8稀释。加入Terasaki板，每孔1l。 其余步骤同微量细胞毒试验。 如结果为阳性，表明受者血清中具有抗供者HLA抗体。,30,深层分析,细胞学分型法,细胞学分型法已被血清学和分子生物学方法代替。单相混合淋巴细胞培养实验还在使用。,31,深层分析,分子生物学技术为基础的HLA分型法,原理 HLA的多态性是由基因中核苷酸序列突变引起的。同一基因的不同等位基因之间核苷酸
11、序列大多是相同的，变异集中在几个DNA片段中。在这些片断中，不同的等位基因具有特定的序列。测定这些片段的DNA序列就可以确定等位基因。,32,深层分析,变异片段 变异片段 变异片段,33,深层分析,a b c d,ac ATCGGTCAAGGCCTATCGATTGCGTAGGC,bd ATCGGTCAAGGCCTATCGATTGCGTAGGC,ac ATCGGTCAAGGCCTATCGATTGCGTAGGC,ad ATCGGTCAAGGCCTATCGATTGCGTAGGC,bc ATCGGTCAAGGCCTATCGATTGCGTAGGC,34,深层分析,根据片段组合指定等位基因,ac,ac,bc,ad,bd,ac,ef,gh,ef,ml,jk,ox,rt,wq,sv,zp,35,深层分析,