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1、新药临床前毒理学评价,1,新药临床前毒理学评价Preclinical Toxicological Evaluation of New Drug,新药临床前毒理学评价,2,Contents,目的意义 急性毒性试验(acute) 长期毒性试验(chronic) 特殊毒性试验(遗传、生殖、致癌) 其它毒性试验(过敏、刺激 etc.) 药物非临床研究质量管理规范（GLP） SFDA新药审评会 案例学习,新药临床前毒理学评价,3,Acute Toxicity Test,概念、目的意义 传统方法基本内容和要求 有关问题 其它实验方法,新药临床前毒理学评价,4,Concept,动物单次或24h内多次给予受试
2、物后，一定时间内(14天)所产生的毒性反应 毒理研究早期阶段进行,新药临床前毒理学评价,5,目的意义(DO STAR),毒性剂量 Toxic Dose 安全剂量范围 Safety margin 毒性反应 Toxic reaction: 性质、程度、量 毒关系、产生、达峰、持续时间及反复产生 毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性 寻找毒性反应靶器官 Target Organ 毒性反应是否可逆 Reversibility 解毒或解救措施 Antidote 确保临床用药安全(重点监测指标),新药临床前毒理学评价,6,目的意义,阐明药物毒性作用及强度、计算相对毒性参数 了解毒性靶器官 为长毒、特殊毒性
3、试验剂量设计 为期临床试验起始剂量选择 为临床毒副反应监护提供参考 其它 (DO STAR),新药临床前毒理学评价,7,OECD口服急性毒性分级,新药临床前毒理学评价,8,相对毒性参数,治疗指数TI =LD50/ED50 安全系数SF=LD5/ED95 可靠或确实安全系数CSF =LD1/ED99 安全范围SM=(LD1/ED99-1) X 100% SED50/ED50, 越大越安全 LD5基本无害量 ED95基本有效量 LD1肯定无害量 ED99肯定有效量,新药临床前毒理学评价,9,为临床毒副反应监护提供参考,中毒症状,起始、持续、恢复时间 中毒靶器官 对抗试验为临床急救提供依据,新药临床
4、前毒理学评价,10,为长毒等试验选择剂量提供依据,长期毒性剂量设计 LD50法 (1/10, 1/50, 1/100) MTD法 ( 1, 1/3, 1/10) 生殖毒性试验高剂量为母鼠MTD 主要药效学剂量限度、一般药理学和药动学剂量设计也要参考急性毒性的LD50,新药临床前毒理学评价,11,为特殊毒性试验选择剂量提供依据,致突变试验 啮齿类动物微核试验高剂量为1/2 LD50 果蝇伴性隐性致死试验的高、低剂量分别为1/2 LD50和1/4 LD50 精原细胞染色体畸变试验高剂量=1/2 LD50 短期致癌试验高剂量=MTD,新药临床前毒理学评价,12,I 期临床选择起始剂量提供参考,细胞毒
5、类抗癌药，I期临床起始剂量= 1/10 LD50,新药临床前毒理学评价,13,其 它,系列化合物的合格率分析(除理化性质为主外)也参考LD50 复方药物的相互作用, 也可通过拆方及合用的LD50来判别相互作用性质 比较不同途径的LD50，获得一些生物利用度信息，为剂型开发提供参考,新药临床前毒理学评价,14,基本原则,执行GLP 整体性 具体问题具体分析 阶段性 随机、对照、重复 方法公认,新药临床前毒理学评价,15,动 物,获得尽量多信息前提下，使用尽量少动物 啮齿类-小鼠或大鼠 非啮齿类-犬或猴 二种动物(啮齿类及非啮齿类) 小鼠18-22g; 大鼠120-150g; 犬用成年犬 初始体重
6、不应超过或低于平均体重的20% 各半 (勤俭办事，服从命令),新药临床前毒理学评价,16,受 试 物,工艺稳定、符合临床用质量标准 标明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，附质检报告 辅料、溶剂、试剂等应标明批号、规格和生产厂家，符合试验要求,新药临床前毒理学评价,17,受 试 物,原料药 临床拟用剂型 复方制剂：复方 + 拆方 (增毒？新毒？) 易降解：含降解产物量最高的受试物进行急毒试验，并与临床样品的急毒试验结果比较,新药临床前毒理学评价,18,给药途径,临床拟用途径 + 原型药物较完全进入循环途径（如静脉注射） 啮齿类ig给药前应禁食12h，不禁水,新药临床前毒理学
7、评价,19,剂量和分组,给药剂量：未见毒性量严重毒性量 设空白和/或溶媒（辅料）对照 小动物4-6个剂量组, 组距0.65-0.85,求LD50 大动物可用50%等量递升法(近似致死剂量法), 求出ALD和MTD，不必达到致死量,新药临床前毒理学评价,20,给药容积,不等浓度等容量给药 常规及最大给药容量为:,新药临床前毒理学评价,21,观察指标及时间,药后4h内详观, 后每天上下午各一,观察14d 记录毒性反应、死亡情况, 中毒症状、发生时间、持续时间、严重程度、恢复期及动物最短、最长死亡时间 其它指标：一般指标、体重变化等,新药临床前毒理学评价,22,急性毒性研究的一般观察和指征,新药临床
8、前毒理学评价,23,病理学检查,大体解剖(濒死动物+死亡动物+存活动物) 组织病理学检查: 体积、颜色、质地等改变时,新药临床前毒理学评价,24,结果处理,实验资料用Bliss法计算LD50。必要时求不同性别LD50 表. XXX急性毒性结果及LD50计算 剂 量 对数剂量 动物数 死亡动物数 死亡率 机率单位 LD50及可信限 (mg/kg) (X) (只) (只) % (Y) (mg/kg),新药临床前毒理学评价,25,结果处理,剂量反应、时间反应关系 反应可能涉及组织、器官或系统 肉眼病变和组织病检，初步判断毒性靶器官 病检报告应附：病检者签名+单位盖章+病理照片,确定NOAEL、 MT
9、D、ALD etc，初步判断受试物的安全范围,新药临床前毒理学评价,26,综合评价,判断反应与药物作用相关性： 时间、发生率、剂量-反应关系 动物种属及背景数据 病理学检查结果 同类药物特点 安全范围、毒性严重程度及可恢复性 毒性作用靶器官 毒性可能涉及部位 大体解剖和组织病理学检查结果,新药临床前毒理学评价,27,注意问题,光化学治疗药和辐射增敏剂急毒试验 照光 + 不照光分别测定LD50 复方(a+b)中各组分毒性相互作用评价,新药临床前毒理学评价,28,注意问题,充分重视预试 毒理学界对LD50看法 试验结果（信息）的一部分 LD50测定不足： 动物消耗量大 获得信息有限 测得数值不准,
10、新药临床前毒理学评价,29,EPA Policies,Discourages the use of the Classical LD50 test Uses Structurally Related Activities (SRA) to obviate the need for testing on animals Recommends the Limit test,新药临床前毒理学评价,30,EPA Policies,Beyond the Limit, recommends approximate lethal dose the up-and-down methods,新药临床前毒理学评价
11、,31,近似致死剂量法(非啮齿类动物),6只健康Beagle犬或猴。犬6-12 m，猴2-3 y 估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50%递增法，设计出剂量序列表,新药临床前毒理学评价,32,First,新药临床前毒理学评价,33,最低致死剂量,最高非致死剂量,最低致死剂量,最高非致死剂量,OR,近似致死 剂量范围,近似致死 剂量范围,Second,新药临床前毒理学评价,34,MTD法,最大允许浓度和最大允许容积仍未测出LD50, 可只求MTD值 一次或24h多次(总量5g/kg)给20只动物 观察14d, 未见死亡, 则MTD XX g/kg; 个别死亡, 则写成LD50 XX g/kg
12、iv要求 pH 5-8，速度：大、小鼠 10-20s ig时空腹, 即禁食12-16h左右,新药临床前毒理学评价,35,常用容量和最大容量(ml),新药临床前毒理学评价,36, 最大无毒性反应剂量（no observed adverse effect level, NOAEL) ： 指受试物在一定时间内，按一定方式与机体接触，用灵敏的现代检测方法和观察指标未发现损害作用的最高剂量 最小毒性反应剂量： 动物出现毒性反应的最小剂量 最大耐受量（maximal tolerance dose，MTD）： 不引起受试动物死亡的最高剂量 最小致死剂量（minimal lethal dose，MLD）： 引
13、起个别受试动物出现死亡的剂量 半数致死量（median lethal dose, LD50）： 在一定试验条件下引起50%受试动物死亡的剂量。,新药临床前毒理学评价,37,长 期 毒 性 试 验 Long-term Toxicity Study,目的意义 基本内容和要求 有关问题 Mechanic? Innovative ?,新药临床前毒理学评价,38,目的意义(DO STAR),毒性剂量 Toxic Dose 安全剂量范围 Safety margin 毒性反应 Toxic reaction: 性质、程度、量 毒关系、产生、达峰、持续时间及反复产生 毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性 寻找毒
14、性反应靶器官 Target Organ 毒性反应是否可逆 Reversibility 解毒或解救措施 Antidote 确保临床用药安全(重点监测指标),新药临床前毒理学评价,39,基本原则,执行GLP 整体性 具体问题具体分析 阶段性 随机、对照、重复 方法公认,新药临床前毒理学评价,40,Procedure,Animals Housing Drug Route Dosage Group Duration Index Recovery Time Report （动饲药径剂组 周指恢时报告）,新药临床前毒理学评价,41,Animal,in vitro体系筛选实验动物种属或品系 理想动物 对受试
15、物生物转化与人体相近 对受试物敏感 已有大量历史对照数据,新药临床前毒理学评价,42,Animals,rodent non-rodent rat beagle dog mouse monkey,新药临床前毒理学评价,43,Animal,二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用Beagle犬, 必要时用猴、猪等 符合等级要求 来源、品系、遗传背景清楚，有动物质量合格证 大鼠6-9 w， Beagle犬6-12 m,体重CV20 各半 必要时，可用疾病模型动物进行试验 Duration 6m, natural death ( rat: 1y-15%, 1.5y-50%, 2y-70-80%) (勤俭办
16、事，服从命令）,新药临床前毒理学评价,44,XXX 体外代谢种属比较研究,结合体内动物药代结果用大鼠和猴进行安评,动物选择,新药临床前毒理学评价,45,XXXX西地那非,已上市药枸橼酸钠西地那非改酸根（化4） PDE5抑制剂，治疗男性ED 选用雄性动物进行下列试验 急性毒性（大鼠、小鼠） 安全药理学（小鼠、犬） 须与已上市药物进行对比 （已上市药需国外进口或买不到时？）,动物选择,新药临床前毒理学评价,46,治疗HER2阳性乳腺癌药物,治疗妇女HER2阳性乳腺癌 用雌性动物进行一般毒理学研究 厂家要求选用雌雄各半动物，何故？,动物选择,新药临床前毒理学评价,47,Housing,T, humi
17、dity, light, ventilation, animal feeds Rat: 5 /cage or separated， acclimation 1w Dog: TB test, anthelmintic acclimation: 1-2w / 1m,新药临床前毒理学评价,48,饲养管理,新药临床前毒理学评价,49,Drug,test article / solvent / excipient name, batch No. , source, specification, purity, preserve condition, etc same quality criterion,
18、新药临床前毒理学评价,50,Route,与临床用药途径一致 临床iv , 大鼠给药1月，ip代替 im或sc应变换注射部位 必要时改变给药途径但应说明原因,新药临床前毒理学评价,51,模拟临床给药途径,纤维蛋白胶：犬腹腔给药 小儿止泻贴剂：相当于脐部给药,途径方式,新药临床前毒理学评价,52,Dose and Group,三个给药组, 单位：mg (IU)/kg 或 mg (IU)/m2 不等浓度等容量给药 低剂量组高于有效剂量，不出现毒性 中剂量组轻微或中等度毒性 高剂量组明显/严重毒性，或个别动物死亡 空白对照溶媒或赋形剂 溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组 阳性对照,新药临床前毒理学评
19、价,53,Dose and Group,大鼠各15只/组 大动物各5只/组,新药临床前毒理学评价,54,特例：等浓度不等容量给药,白蛋白：疗效与蛋白浓度有关 紫杉醇脂肪乳：乳剂的比例影响紫杉醇安全性,途径方式,新药临床前毒理学评价,55,Correspond duration of clinical ad. with animal ad.,新药临床前毒理学评价,56,注：表中给药期限均为最短给药期限，不包括恢复期，均为完整试验,新药临床前毒理学评价,57,Index-Clinical Examinations,rodent non-rodent signs of ill health +pup
20、il , T behavioral changes breath, sialosis reaction to treatment vomiting Dead or moribund animal: necropsy within 1h,新药临床前毒理学评价,58,Index-Hematology,受试物对造血系统有影响，应重视骨髓检查,新药临床前毒理学评价,59,Index-Clinical Chemistry,新药临床前毒理学评价,60,Index-Urinalysis,新药临床前毒理学评价,61,Index-Pathology称重并计算系数,calculate organ weights
21、relative to body weight , paired organs weigh together,新药临床前毒理学评价,62,Index-Pathology病检脏器组织,新药临床前毒理学评价,63,Index-Pathology病检脏器组织,新药临床前毒理学评价,64,Index-Pathology,heart liver spleen lung kidney brain adrenals pancreas stomach duodenum jejunum ileum colon cecum（盲） pituitary thymus spinal cord prostate test
22、es epididymides uterus ovaries optic nerve injection site bone and marrow urinary bladder lymph nodes(mesenteric, local) thyroid & parathyroid lobes,新药临床前毒理学评价,65,脏器取材样式（SOP),肺脏,脑,新药临床前毒理学评价,66,01,肝脏,02,03,04,05,肾脏,膀胱,心脏,肺,06,脾脏 胸腺,07,甲状腺,08,气管,09,脑垂体,10,胃,切片中组织排列和方向,新药临床前毒理学评价,67,IndexECG, Eye,大动物长
23、期毒性必须做 ECG观察指标：心率、P波电压、P-R间期、R波电压、QRS时间、ST段、T波电压和Q-T间期,新药临床前毒理学评价,68,Recovery,Observation : 1/31/2 animal, 26w Late toxic reaction and reversibility Items : same as treatment period,新药临床前毒理学评价,69,测试次数,能反映动态变化 一般行为、食量每天观察记录 大鼠体重每周一次 大动物生理指标每半月一次 大动物ECG 导联，给药前、给药期间、停药及恢复期均要检测 发现有阳性指标应加大观察密度,新药临床前毒理学评价
24、,70,Observations,Western Chinese Recombinant 34 times 2 times antibody 6m(rat) 9m(dog) Toxic reaction: properties, degree, dose-toxicity relationship, initiating time，peak time, lasted time, late reaction toxicity, accumulating toxi-city, tolerance,新药临床前毒理学评价,71,Frequency of lab. investigations,rat=
25、3m rat 6m Non-rodent last ad. interim twice pretreatment recovery end last ad. once every 1-3 m recovery end last ad. recovery end,新药临床前毒理学评价,72,资料整理,首页 试验指导者、课题负责人、病理学检查、血液生化指标测定、血液学指标测定及给药观察者 SD申明 QA申明 摘要 正文 合理的统计图、表 有差异的指标应进行统计标示,新药临床前毒理学评价,73,Problems,Pretest Animal & Housing Route Dose Duration
26、 Observation Index Toxicokinetcs Data handling Archives,新药临床前毒理学评价,74,Pretest,What depend on? Overseas pre-clinical / clinical data Acute toxicity , pharmacodynamics and pharmacokinetics or intended clinical dose How long? 2w - 1m Biological product: antibody?,新药临床前毒理学评价,75,Dose,LD50 MTD MBS ACD 3m
27、6m 1/10 1 10Cmax 50100 30 50 1/50 1/3 5Cmax 3050 1525 1/100 1/10 Cmax 1020 510 half for dog and monkey,新药临床前毒理学评价,76,常用动物等效剂量折算表,新药临床前毒理学评价,77,Dose,高剂量原则上应使动物产生明显毒性 低毒性药物高剂量的选择： 问题: 临床拟用剂量可靠吗？ 高剂量与临床剂量的比值？ 与动物有效剂量的比值? 办法: 是否线性动力学？ 药物完全吸收了吗？-毒代动力学证据 是否达最大给药浓度和体积(限制性因素)?,新药临床前毒理学评价,78,剂量设计,依据充分 指导原则 文
28、献资料 官方资料 设计合理 药效剂量 药代数据 种属差异 作用机制 预试结果,新药临床前毒理学评价,79,特例：犬的剂量高于大鼠,大鼠：10、30、 60 mg/kg (iv 60天) 30、60 mg/kg给药后尖叫，体重下降 胆红素，血糖，局部刺激 犬： 25、50、100 mg/kg (静滴60天) 50、100 mg/kg给药后动物流涎、皮肤潮红 胆红素，血糖，局部刺激,剂量设计,新药临床前毒理学评价,80,大鼠雌雄剂量不同,雄大鼠：20、60、120 mg/kg (ig 30天) 雌大鼠：10、30、 60 mg/kg (ig 30天),雄大鼠对该药的生物利用度为雌大鼠的一半，故给药
29、剂量加倍,剂量设计,新药临床前毒理学评价,81,分组,分别随机分组 开始实验时体重CV20 大动物：给药前生理生化指标过高或过低的去掉,新药临床前毒理学评价,82,Index,Possible Toxic Reactions pharmaco- chemical pretesting published logical effcts structure results data,新药临床前毒理学评价,83,Index-hematology & chemistry,Reticulocyte count AST ALP BUN Alb,新药临床前毒理学评价,84,Index-pathology,T
30、issue: free of fat half rationed： no changes(-) 0, suspected () 0.5，mild(+) 1， median(+) 2， severe (+) 3 Local inflammation, WBC infiltration, local bleeding , haemostasis, suspected cell degeneration self-infected, sacrifice induced,新药临床前毒理学评价,85,指标增加,PEG化EPO（化学1.1） +免疫源性（抗体及其性质） +免疫毒性细胞及体液免疫：IgG、I
31、gM、C3、C4、CIC、T淋巴细胞分型（CD4+、CD8+)，IL-6,INF-等）,指标检测,新药临床前毒理学评价,86,测试方法,简便 快速 灵敏 准确 公认,新药临床前毒理学评价,87,Toxicokinetics,毒性剂量系统暴露的代谢动力学 可以描述系统暴露与暴露剂量、暴露时间和毒理学结果之间关系 目的在于解释长期毒性试验结果,新药临床前毒理学评价,88,Toxicokinetics,合适采样点，获得AUC、Cmax、Tmax等参数 结合药物血浆蛋白结合率评价系统暴露量 长毒试验各剂量全部或部分动物，以估算高剂量药物的动力学过程是否属非线性 鼓励创新药物进行毒代动力学研究,新药临床
32、前毒理学评价,89,Data Handling,Ration data: xs, international unit vs control and dosage group, vs d0 Statistics: t test or F test，Ridit analysis,新药临床前毒理学评价,90,资料整理,raw data, documentation, records, protocol (and amendments thereto) specimens, reserve samples control article final report(signed) 原始资料应保存完好，
33、我国规定原始资料至少保存至生产后5年,新药临床前毒理学评价,91,均值和单个数据,Rodent：组均值单个动物，背景数据和文献数据可参考 Non-rodent：数量少、个体差异大，单个动物的试验数据具有重要毒理学意义。须与给药前、对照组和背景数据进行多重比较，文献数据参考价值有限,新药临床前毒理学评价,92,统计学意义和生物学意义,有统计学意义并不一定有生物学意义 判断因素 数据变化剂量反应关系 其他相关参数改变 与历史背景数据比较 异常数据合理解释,新药临床前毒理学评价,93,正确判断毒性反应,给药组和对照组之间差异来源 与受试物有关的毒性反应 动物对药物适应性改变 正常生理波动 判断关注
34、剂量反应关系 参数变化幅度和性别差异 分析毒理学变化参数关联和机制 单个参数变化判断应慎重 结合TK,新药临床前毒理学评价,94,毒性反应对于临床试验意义,种属差异 无关毒性：高剂量，非线性动力学代谢 特异反应 难以检测：头痛、头昏、头晕、腹胀、皮肤搔痒、视物模糊 疑毒从有,新药临床前毒理学评价,95,机制研究（探索药理/毒理信号通路）,鉴别新分子实体是否有新的药理/毒理作用机制，加深对药物的认识 与已有类似药物作用比较，判断是否属于新作用机制 采用多种先进的生理、生化和分子生物学方法和技术对机制进行多层次研究,例：1971年美国颁布国家癌症法以来，前列腺癌、肝癌、胰腺癌等发病率和/或死亡率没
35、有明显改变,新药临床前毒理学评价,96,Pfizer研发CETP抑制剂损失8亿$,新药临床前毒理学评价,97,Torcetrapib的副作用源自脱靶效应,辉瑞公司ILLUMINATE试验详细数据表明torcetrapib提高死亡率可能源于其脱靶效应 动物研究发现切除肾上腺，可以阻断torcetrapib的升压效应，验证了醛固酮所起的作用 美国转化医学协会的主席Bruce Littman指出，torcetrapib事件另一个教训是，当涉及到黑箱机制时，尤其是与安全性有关的问题时，一定不要把所观察到的问题仅仅作为风险那么简单,Nat Rev Drug Discov VOL 10 | MAR 201
36、1 | 163,新药临床前毒理学评价,98,2011年立普妥专利到期,辉瑞急切希望torcetrapib弥补2011年立普妥专利到期带来的巨额损失，过度扩大了torcetrapib可能带来的经济效益，偏离了研发的科学性 20102015，辉瑞至少失去18个药物的独家专利权。这些药物2009年销售收入达256亿美元，占总收入60%,新药临床前毒理学评价,99,2012年全球处方药市场销售20强,单位：亿美元,新药临床前毒理学评价,100,单位：亿美元,2012年全球处方药市场销售20强,新药临床前毒理学评价,101,整体性综合评价,结合药学、药理学、PK、TK和其它毒理学研究(+临床研究)，利弊
37、权衡，综合评价 找到：不良反应、毒性靶器官、安全范围、临床需重点检测指标及临床监护或解救措施,26 SCIENCE VOL 334 7 OCT 2011,人卵细胞培养出胚胎干细胞,Cell 153, 111, June 6, 2013,人卵细胞停滞于减数分裂中期,目前还无法进行人类克隆,新药临床前毒理学评价,102,精子指导胚胎早期发育 子代继承父源的DNA甲基化图谱，抛弃了母源的图谱，精子中携带的信息指导胚胎的发育,Cell 153, 759772, May 9, 2013,新药临床前毒理学评价,103,The fourth mutation allowed the virus to spr
38、ead more effectively, infecting ferrets in neighbouring cages.,3 MAY 2012 | VOL 485 | NATURE | 13,新药临床前毒理学评价,104,22 JUNE 2012 | VOL 336 | SCIENCE,新药临床前毒理学评价,105,22 JUNE 2012 | VOL 336 | SCIENCE,SCIENCE: 让人们对H5N1型禽流感病毒的潜在威胁提高警惕，而新数据的公开则有利于降低这一病毒引发人际传播的可能性，激发病毒监控和防治方面的新研究，使世界变得更安全,新药临床前毒理学评价,106,Innovative,Animal,Dose,Route,Index,Data handling,新药临床前毒理学评价,107,Summary,Importance Objective (DO STAR) Methods Standard & innovative,新药临床前毒理学评价,108,Stay Hungry 求知若渴 Stay Foolish 大智若愚,共 勉,新药临床前毒理学评价,109,第二军医大学药物安全性评价中心 第二军医大学卫生毒理学教研室,谢 谢!,