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1、细菌鉴定的一般步骤,1,细菌鉴定的一般步骤,李荣 南京农业大学资环院 办公室：综合楼B419 邮箱：,细菌鉴定的一般步骤,2,一、确保菌株的纯度,在鉴定菌株之前首先确保菌株的纯度。 假若菌株没有纯化好，将会做大量的无用功,细菌鉴定的一般步骤,3,二、PCR扩增16S rRNA片段,菌落直接PCR 菌体新鲜、加菌量少、阴性菌较阳性菌容易、退火温度要高点 DNA扩 PCR 高盐法或CTAB法提取细菌总DNA DNA量不要加太多,细菌鉴定的一般步骤,4,三、16S rRNA片段测序,PCR产物直接测序 条带特异，注意产物的浓度要足够，不要纯化 PCR产物克隆测序 挑单菌落，菌液测序或质粒测序。,细菌
2、鉴定的一般步骤,5,四、系统发育树的构建,首先将所获得的16S rRNA片段序列在NCBI数据库中进行序列的比对（序列提交GenBank 获得登录号） 从相关数据库下载相关模式种16S rRNA片段序列 采用MEGA 软件邻近法做树,细菌鉴定的一般步骤,6,核酸序列数据库,现在比较通用的核酸序列数据库有：,Genbank（national institutes of health ）、 RDP。 EMBL（European molecular biology laboratory）、 DDBJ（DNA data bank of Japan）,细菌鉴定的一般步骤,7,五、发育树的构建及作用,确认
3、目标菌株跟模式菌株间的遗传距离 确认目标菌株的分类定位 同源性较低，认定可能为新种或新属，有必要重新扩增序列克隆测序,细菌鉴定的一般步骤,8,六、序列同源性差异分析,16S rRNA序列同源性在大于97% 慎重考虑 16S rRNA序列同源性在97%以下 有做新种的意义 16S rRNA序列同源性在95%以下 有可能是新属,细菌鉴定的一般步骤,9,新属的判定依据,16S rRNA序列同源性在95%以下 拥有该科的共有特性 与相邻属的脂肪酸组成及含量有显著差异 生理生化差异明显 极性脂成分有差异 注意：判定依据要根据实际情况而定,细菌鉴定的一般步骤,10,七、几个发育树例子的分析,细菌鉴定的一般
4、步骤,11,地衣芽孢杆菌模式种的生理生化特性,细菌鉴定的一般步骤,12,分类在一个支上，同源性大于99%，初步判定为地衣芽孢杆菌 生理生化特性的分析等 DNA杂交(实际情况而定),细菌鉴定的一般步骤,13,细菌鉴定的一般步骤,14,细菌鉴定的一般步骤,15,细菌鉴定的一般步骤,16,细菌鉴定的一般步骤,17,细菌鉴定的一般步骤,18,确定菌株种属,首先确定菌株属的定位（与同属模式菌株数据的比较） 查阅文献 到IJSEM杂志阅读邻近种属的分类文章,细菌鉴定的一般步骤,19,形态学分析,菌落形态,菌株 wd的LB平板菌落照片,细菌鉴定的一般步骤,20,菌体照片间的比较,菌株 wd扫描电镜照片,细菌
5、鉴定的一般步骤,21,Starkeya koreensis,Lm et al. IJSEM (2006), 56, 24092414,细菌鉴定的一般步骤,22,Ancylobacter rudongensis,IJSEM (2004), 54, 385388,细菌鉴定的一般步骤,23,Angulomicrobium amanitiforme,IJSEM (2004), 54, 651657,细菌鉴定的一般步骤,24,生理生化性质,IJSEM (2004), 54, 651657,细菌鉴定的一般步骤,25,选择模式种进行实验,菌种 15561 Angulomicrobium amanitifo
6、培养基编号： 1 830 菌种 5895 Angulomicrobium tetraedrale 培养基编号： 628 菌种 18406 Starkeya novella 培养基编号： 830 菌株送国际菌种保藏中心保藏,细菌鉴定的一般步骤,26,细胞壁脂肪酸（与模式种同步试验）,细菌鉴定的一般步骤,27,测定G+C含量,细菌鉴定的一般步骤,28,DNA-DNA杂交同源性测定,细菌鉴定的一般步骤,29,API实验进行生理生化的特性的获得 “Biolog”鉴定系统进行糖代谢的特性研究,细菌鉴定的一般步骤,30,生理生化特性总结,Lm et al. IJSEM (2006), 56, 24092414,细菌鉴定的一般步骤,31,总结数据，文章撰写,