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1、三个绵羊群体BMPR-IB基因多态性与产羔数的相关分析 赵金山1，柳楠2*，王金文3，曲绪仙4，刘猛2，李晶2（1.青岛市畜牧兽医研究所，山东青岛266100；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109；3.山东省农科院畜牧兽医所，山东济南250100；4.山东省畜牧兽医总站，山东济南250022）摘要：选择BMPR-IB基因作为侯选基因，采用PCR-RFLP方法检测其在萨福克羊，小尾寒羊及萨寒杂交F1代群体中的多态性分布情况，研究BMPR-IB基因对产羔数的影响。研究结果表明:在萨福克绵羊中只存在1种基因型，即野生型(+);在小尾寒羊中检测到三种基因型，纯合突变型(BB)，杂合突变型
2、(B+)和野生型(+)，基因型频率分别为：0.14，0.80和0.06。在萨寒杂交绵羊中发现两种基因型(B+和+)，基因型频率分别为：0.99和0.01。萨寒杂交羊的多羔率和平均产羔率均明显高于纯种萨福克羊，说明小尾寒羊在提高萨寒杂交羊繁殖性能方面是有效的。关键词：绵羊；BMPR-IB基因；多态性分析；产羔数近年来，随着人们生活水平的提高，人们对肉类消费量不断提高，尤其是羊肉以其高蛋白、低脂肪、胆固醇少的特点倍受消费者喜爱。目前我国羊肉产量低，人均年占有量仅有2.53kg，远远不能满足市场消费需要，肉羊产业发展空间很大。近几年，山东省加快肉羊产业发展，从国外引进了大量的杜泊羊、萨福克羊等大型肉
3、用品种，这些品种具有生长发育快、饲料报酬高和适应性强等特点，作为杂交父本与山东地方品种具有多胎特点的小尾寒羊开展杂交改良，选育新品种。一般来说，绵羊繁殖速度较慢，年产一胎，一胎单羔，与规模化快速发展不相适应，加上繁殖性状的遗传力较低，采用常规育种按表现型选择，进展速度较慢。所以人们期望借助生物技术手段，采用分子遗传学方法实现基因型选择，从而达到高效快速繁殖的目的。本研究围绕小尾寒羊与萨福克羊的杂交组合，采用分子生物学方法，探讨多胎基因作为分子标记，产羔数进行辅助选种的方法，为新品种选育提供技术支撑。目前，国内外在绵羊繁殖性状分子标记研究方面，大量工作集中在对多产性状的主效基因的寻找与判定上。研
4、究最多的就是绵羊的FecB基因。FecB基因是位于绵羊6号常染色体的主效基因，对绵羊的排卵率及产羔数有很大影响。该基因实际为骨骼形态发生蛋白IB型受体基因（BMPR-IB即bonemorphogeneticproteinreceptorIB），在澳大利亚多胎绵羊品种Booroola羊中BMPR-IB基因编码序列中有1个A746G突变，正是这个突变(Q249R)与Booroola母羊的高繁殖力密切相关，导致携带该突变基因的绵羊产羔数增加。王根林等通过“Forced”限制性酶切片段长度多态性PCR技术分析发现小尾寒羊存在Booroola(FecB)多胎基因。萨福克羊是大型肉用品种，具有适应性强、生
5、长速度快、产肉多等特点，适于作羊肉生产的终端父本，但其缺点是繁殖力低。本研究采用PCR-RFLP分子标记技术,对小尾寒羊及其与萨福克羊的F1代的BMPR-IB基因多态性进行系统检测和统计分析，并寻找其与产羔数的相关关系，为建立繁殖性状分子标记辅助选择技术体系，解决多胎肉用绵羊杂交育种技术关键提供依据。1材料与方法1.1耳组织采样与DNA提取本试验采样羊群来自项目区杂交育种群羊场，采样数量为：菏泽市仝庄羊场和皇镇羊场的小尾寒羊108只，聊城茌平方盛种羊有限公司的萨寒杂交羊81只和纯种萨福克羊35只。每只羊在耳尖部用75酒精棉球消毒后用钳子耳组织取样约5g，-20保存；采用酚-氯仿法抽提基因组，4
6、保存备用。1.2引物的设计与合成根据绵羊BMPR-IB基因序列设计并由上海生工生物工程公司合成一对引物，引物一个突变点，可使突变体的扩增产物产生1个Ava内切酶酶切位点，不携带突变的扩增产物则无此酶切位点。上游引物：P1:5GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG3下游引物：P2:5CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC31.3实验试剂 蛋白酶K,AvaII限制性内切酶购于TaKaRa公司;DNALadder2000(分子量为2000,1000,750,500,250,100bp）,TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司;琼脂糖、SDS等购于大连宝生物工程有限公司
7、。1.4PCR扩增与电泳PCR反应体系：总20lTemplete：1.5lBuffer：2.0ldNTP：1.5lMgCl2：1.5lPrimer1,2：各0.9lTaqE：0.2lddH2O：11.5lPCR反应条件：94预变性5min，9430s，6030s，7230s，35个循环，72延伸5min。预期片断大小为140bp。PCR反应产物用1.0琼脂糖凝胶电泳检测。1.5酶切酶切反应总体系10l，Ava酶:0.5l，PCR产物:5l，BufferR+:1l,ddH2O:3.5l。混匀后37水浴4h。酶切产物用2.5琼脂糖凝胶电泳检测。2结果2.1BMPR-IB基因PCR扩增结果采用引物P
8、1，P2对3个绵羊群体基因组DNA分别进行扩增，其扩增产物用1.0琼脂糖凝胶电泳检测，得到140bp左右的条带，条带清晰且特异性好，与预期扩增片断大小一致（图1）。图1BMPR-B基因PCR扩增结果（M:MarkerD20001-5:PCR产物2.2PCR-RFLP电泳结果与分析扩增产物用Ava酶切后，用2.5的琼脂糖凝胶电泳检测，所有绵羊共检出三种带型（图2）。由于绵羊BMPR-IB基因在746处有一个单核苷酸多态（A-G突变），因此该位点为G时，会产生限制性内切酶Ava的酶切位点（GGACC）,Ava酶切PCR产物后会产生2个片断（110bp和30bp），该位点为A时（AGACC），则不存
9、在Ava的酶切位点，酶切PCR产物后只有一个片断（140bp）；该位点为A/G杂合时，酶切PCR产物后会产生3个片断（140bp、110bp和30bp）。只有110bp片断的为BB基因型（第1、2、4泳道）；只有140bp片断的为+基因型（2、5、6泳道）；有140bp和110bp两个片断的为B+基因型（7、8泳道）。图2BMPR-B基因Ava酶切结果（M:MarkerD20001-8:酶切产物2.3BMPR-B基因多态性及不同群体产羔数的统计分析表1不同群体基因型频率与基因频率品种只数BB频率B+频率+频率B频率+频率小尾寒羊1080.14(15)0.80(86)0.06(7)0.540.4
10、6萨寒杂交羊810(0)0.99(80)0.01(1)0.490.51纯种萨福克350(0)0(0)1.00(35)01.00采用SPASS软件对不同基因型两种绵羊样品中的卡方独立性检验，结果表明，三种绵羊间基因型频率差异极显著。表2对不同群体羊产羔数的统计品种单羔母羊数多羔母羊数多羔率单羔率平均产羔率小尾寒羊12340.7390.2612.11萨寒杂交羊8150.6520.3481.74纯种萨福克1320.1330.8671.13由表2可以看出，在导入B等位基因后，萨寒杂交羊的多羔率和平均产羔率均明显高于纯种萨福克羊。3讨论目前在国内外有关萨福克绵羊及其杂交小尾寒羊BMPR-IB基因分析的报
11、道尚不多见，尤其未见到有对萨寒杂交羊产羔数相关分析的报道。绵羊的BMPR-IB基因位于微卫星标记OarAE101和BM1329之间一个10cM区间内，是TGF-受体超家族的成员，主要在颗粒细胞上表达，被定位到6号常染色体，编码区由10个外显子组成，共1509bp，编码502个氨基酸。发生突变的母羊颗粒细胞加快分化，进而使卵泡成熟速度加快，排卵数增加，进而增加母羊的产羔数。本研究中小尾寒羊BMPR-IB多胎基因PCR-RFLP分析结果与王启贵等，柳淑芳等所报道的基本一致，进一步证实了小尾寒羊中普遍存在BB,B+和+三种基因型；萨福克羊不携带B等位基因，但在其与小尾寒羊的杂交羊中均检测到BMPR-
12、IB的突变，说明BMPR-IB基因的遗传方式符合孟德尔遗传规律，可以通过杂交保留此突变，使杂交后代具有产多羔的性能。本研究结果表明：萨福克羊与萨寒杂交羊基因型频率的差异极显著，而且从产羔数的对比中也可以看出，萨寒杂交羊的多羔率和平均产羔率均明显高于纯种萨福克羊，说明利用多胎品种小尾寒羊对萨福克羊的繁殖性能进行杂交改良是有效可行的。本研究方法和结果可应用于萨寒杂交羊选育过程，将该项技术与常规育种方法相结合，通过对杂交后代繁殖性能表型的鉴定与基因型对比，淘汰杂交后代中野生基因型个体，选择杂合突变基因型个体，可望获得高繁殖性能的肉用杂交绵羊新品种(系)。由于现场条件限制，个别绵羊群体采样数量偏少，还需扩大样本数量，增加结果的可信度。