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1、DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析作者：李力，徐永莉，张月云，赵成坚【摘要】目的对DNA分子遗传标记技术在中药材鉴定领域的应用作一综述。方法通过查阅20世纪90年代以来发表的文献进行归纳分析。结果DNA分子遗传标记技术具有微量、快速、特异性强、准确可靠、对样本要求较低的特点；使用较多的方法主要有RAPD、ISSR、ITS标记以及rRNA基因序列分析技术。同时，DNA分子标记技术也存在着使用局限、对实验硬件和从业人员的技术要求高、成本较高、技术复杂度高铵、对不同部位入药的药材仍晖然难以区分以及无法用于成缭药、复方、提取液鉴定等弱苛点。结论DNA分子遗传标记作为中药材鉴定的方法还皲有待
2、发展和完善。【关键词】DNA分子遗传标记俚；中药材；鉴定Abst峭ract：ObjectiveThepapersu鲠mmarizestheresearchesofa记pplicationof茜DNAmolecular蚴markersinChinesemedicina估landanalysis胪wereusedbyre栌ferringtolit缳eraturerelea妗sedsince1990猖s.ResultsDNA署MarkerTechnologieshavech垸aracteristic瘥softrace,rap泗id,peculiari骑ty,accuracya疗ndcredibili
3、t徭y,lowerrequi缺rementsforth凳esample.Rand独omamplifiedpolymorphicDN馘A(RAPD),inter-simplesequencerepeat(ISSR),interia唬ltranscribed们spaoers(ITS)andrRNAgenesequencingtechnologyareo莼ften,DNAMark择erTechnologi咔eshavesomedi裆sadvantagesthatemployeesarerequireds滩pecialskills,thecostishighandthetech濑niqueiscomp
4、licated,whileitisdifficul徘ttodistinguishdifferentp诎artsofChines馁emedicinalma饰teriausedmed杩icinallyandi篁dentifypaten访tmedicine,Ch侵inesemedicin魁ecomplexprescriptionandt碍heextractofC仗hinesemedici则nalmateria.ConclusionThe搞methodsofChi锢nesemedicina褥lmateriaidentificationbyDNAmolecular埴markersneedt其odevel
5、opandimprove.Keyw糸ords：DNAmole檠cularmarker；狩Chinesemedi蹶cinalmaterials；Identifi宿cation针对我国药竹材种类繁多,来源复杂且品伍种混淆情况严重的状况,为纺了保证临床用药的安全及质逗量和疗效,广大中医药领域魁的专家学者多年来一直都致蹋力于寻找更加科学的鉴定方沓法来解决这一难题。随着当氅今生命科学不断取得重大突俨破,其中分子生物学技术以屎其准确性高、重复性好等特烩点尤为引人瞩目。DNA分哜子标记大致可分3类:首先是以电泳技术和分子杂交技戒术为核心的分子标记技术,潞其中代表技术有RFLP分坳子标记技术；第2类是以电犯泳
6、技术和PCR技术为核心狐的分子标记技术,实际使用浼较多的代表技术为:RAP势D、简单序列重复间区标记琏技术(inter-sim即plesequencer首epeatISSR)和AFLP(Amplifie砭drestrictionfragmentPoly询morphism)。第3崧类是以DNA序列为核心的攵分子标记技术,其代表性技术有ITS(interi忏altranscribe恍dspaoers)测序分酐析技术。本文仅就最近十几桔年来DNA分子标记技术在谩中药鉴定方面的应用作一分雷析，并就其应用前景进行讨论和展望。1经典的D财NA分子标记技术此类技镅术的代表是限制性片断长度姨多态性(Restr
7、ict湎ionFragmentL宰engthPolymor遐phism，RFLP)。RFLP是最早发展的分子标记，是由BostEin首先提出，Soller和烂Beckman最先应用于嗄品种鉴别和品系纯度的测定嘻，这是最早发展的分子标记筌技术。其基本原理是利用限些制性内切酶酶切不同个体基贝因组DNA后，与同位素或窨非同位素探针标记杂交，从帮而显示与探针含同源顺序的惝酶切片段在长度上的差异。撺RFLP探针的来源主要是俏RG克隆和cDNA克隆，蹲其中cDNA探针保守性较强，许多同科物种cDNA爷探针都可以作为通用探针。酋在实际应用过程中，人们普箭遍感到经典的RFLP技术须经酶切、电泳、Sout程he
8、rn转移、与探针杂交厅、放射自显影等步骤,在实摈际应用中很不方便，费时费力,并受到探针来源的限制箬，多态性检出效率低(只能鹄检测探针长度内切酶识别位斋点上的变异)。同时要求的猱DNA量较大,实验材料必镅须新鲜,因此难以适用于干邡燥药材的鉴定,目前在中药鉴定领域已很少使用,已归蝌为被淘汰的技术。在多源遨性中药材如伞形科北沙参、躅柴胡,菊科苍术属豆科甘草君属,羽扇豆属，YamazakiM,茄科澳茄属(D铂uborsias)MizukamiH,3种苍术MizukamiH的基原鉴些定、资源分析及其地理品系辕(居群)间亲缘关系研究方甩面有了一些报道。2基于PCR的DNA分子标记技术此类标记技术的代表端为
9、:RAPD技术又称为锚循定简单序列重复技术由加拿茹大蒙特利尔大学的Ziet熬kiewicz等于1994年提出。它用锚定的微卫肩星DNA为引物，即在SS淋R序列的3端或5端加昙上24个随机核苷酸，在镳PCR中，锚定引物可以引刊起特定位点退火，导致与锚菊定引物互补的间隔不太大的粱重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增interSSR区域的多个条带羌通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨忖，扩增带多为显性表。IS枳SR标记技术特点：实验操甙作简单、快速、高效，不需情要繁琐地构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤。I掖SSR标记技术结合了RA嬷PD标记技术和SSR标记帱技术的优点，耗资少，
10、模板烽DNA用量也少。XX年叼以来，此标记技术受到许多捶学者的青睐，邱英雄等2荻031分别对明党参和峄川明参、南北五味子、罗汉岜果、金花茶、怀区地黄、铁鲜皮石斛和黄精、麦冬、金钗堰石斛、丹参和半夏等药材的秘基因组DNA进行PCR扩天增，建立并优化了ISSR钢-PCR反应体系，结果证醪明ISSR标记可以作为不遐同产地药材鉴别的有效分子诼标记。此外，XX年以来议，李磊等3236分什别对4种叶型性状半夏和掌镊叶半夏、山茱萸、银杏、益蚍智和乌头等药材利用ISS匿R分子标记进行了分析，并讶取得良好结果。DNA序列分析技术以DNA序列为核心的分子标记技术。建鹋立在PCR技术基础之上的蜈DNA测序分析技术(
11、DN堀Asequencing)铈的开发使DNA分子标记技术取得了又一次的突破性进弓展。动植物在进化过程中玖，其基因会发生碱基的重排唱、替代等，从而导致基因序问列的差异。通过检测其DN鳘A片段序列的差异，即可将不同的种区别开来。近年来副，由于DNA测序技术的发媚展以及人们对一些基因结构雎、功能的进化规律认识的更加深入，一些基因已用于动植物的进化与分类、物种鉴两别研究。利用已知基因的结糈构、序列，可以为PCR引镅物的设计及目的基因的扩增提供前提条件。而基于PC捣R的DNA直接测序技术，极大地提高了DNA序列分秧析的效率，促进了该项技术眍的应用研究。目前用于中药怫DNA测序的基因主要有植物叶绿体基因
12、组的rbcL倥，matKrpoC等；植嗌物核基因组的rRNA、I逐TS等；动物线粒体基因组Cytb基因等，这些被选距基因的共同特点是进化速率环差异大，基因序列变异大，冂基因序列均匀地分布于整个基因组，分辨率高，一般用荷于种级以上的分类系统研究以及分析研究动植物的亲缘螓关系与进化等。马小军等猊3740XX年分别坝通过测定山参、大戟、巴戟天以及细辛和柴胡的序列，获得了可喜的效果。此外蘑，徐红等4147X芍X年分别对川芎、西洋参、眼竹节参、石斛、姜黄、大黄茱、当归及小秦艽、肉苁蓉、办广藿香、太子参、葛根等进苦行了药材鉴别，根据序列能肖够将研究对象区别开。动物类药材多用线粒体细胞色珉素b基因片段的序列
13、变异鉴巽别药材。1998年吴平襞48通过分析对乌龟、中撤华鳖和山瑞鳖线粒体12S娟rRNA基因片段序列来区旯分正品和混淆品；还通过扩增约450bp的12Sr悲RNA和约490bp的Cytb基因片段对海马作了嗝DNA序列分析，可作为其受它动物药材干样品鉴定的参揞考。1999年王义权等49扩增了乌梢蛇及其混淆品的Cytb基因片段，痉通过比较蛇的Cytb基因246bp的同源DNA序哎列，可以准确区分乌梢蛇及其混淆品。3评价与展望评价中药材品质鉴定是中药质量控制的首要环疥节，多年来人们一直在寻找耿科学有效的鉴定中药材的方茛法，从应用的现状不难看出搛DNA分子标记技术在该领峤域的应用已经取得了一些成珩绩
14、。DNA分子标记技术作钒为中药材品质鉴定方法之一具有以下几点优势：微量、惟快速、特异性强、准确可靠丰，且不受药材生长发育阶段圈、供试部位、环境条件、产茏地、采收季节、贮藏等因素蛸的影响，对样本要求较低，嬉无论是药材还是成药、甚至韧是粉末都可以用来鉴别；归昆纳起来DNA分子标记技术素已应用于几个方面：用于雳中药真伪、近缘药材及代用畅品鉴别，使用的方法主要有鲜RFLP，RAPD，AP瑞-PCR，ITS等标记；药材的野生类型与栽培品种的研究，使用的方法主要有RAPD，AFLP；楔粉末、中成药鉴别，使用的啁方法主要有RAPD，RT棺-PCR；本草考证与出馥土中药研究，使用的方法主卫要是测序技术；道地药
15、材粮研究，使用的方法主要有R钱APD，RFLP，AFL睇P标记和ITS与rRNA基因序列分析技术。文献报劁道的研究人员主要集中在中箦国、日本，但已显示了强劲朋的发展势头。另一方面，DNA分子标记技术在中药材梗鉴定中的应用也存在着明显蘼的不足。主要表现在几个方葭面：作为鉴别药材的方法佚学的研究，投入的人力物力霖都还很有限，与中药其他方淙面研究的结合还未开展，所以从方法学上来讲，中药材包的分子鉴定方法还需要发展搅才是。使用还很局限，由嘌于分子标记技术对实验室硬屺件和从业人员的技术要求很诏高，再加上成本也较高，所峙以真正用于中药材鉴别的方尕法还很少，已涉及的中药品扮种也很有限，从文中可看出倨，仅RA
16、PD、ISSR以赢及测序技术使用较多，涉及汛的中药品种也只有几十种；峪正因为技术复杂度的制约，璎此类鉴别技术对于生产收购煞第一线的人员仍然显得复杂眼，还无法推广使用。数据倮分析所使用的软件还很局限莲，测序后对数据进行分析，饣这是判断药物近缘关系的关挤键步骤，数据分析必须借助魏多种软件及适当的方法，以钰往多采用的NEI(197牮2)方法现已显单一了，目梆前用于其他生物技术的分析软件早已多元化了,且很多刨新的软件主要应用于中药材的遗传多样性分析当中。鐾DNA分子标记技术对不同部位入药的药材仍然难以区分，各部具有同样DNA标黉记式样。对于成药、复方、岐提取液的DNA标记还未见觏报道。展望从分子标记鲴
17、技术的发展来看，前后也就嗉二十多年的时间，它也是随姹着分子生物学技术及信息技术的发展而发展的，不可否坡认的是分子标记技术肯定是本世纪的主流技术。除了以上分子标记技术外，现在还町发展有单核苷酸多态性标记绊技术、相关序列扩增多态性溱标记技术、靶位区域扩增多角态性标记技术、荧光原位杂猕交技术、变性梯度凝胶电泳钥技术等50，这些技术已被用于其它一些领域的研究之中，因此，作为方法学旁的研究，在中药鉴定领域还恧应该加大人力物力的投入，啁选择和发展出更适合中药鉴定或针对不同鉴定对象的鉴何定方法，最终推动分子生物兕学技术对更多的中药品种或枝剂型进行鉴定。同时我们也婀看到，仅仅依靠分子标记技吏术在相当长的时期内
18、还不可橛能解决中药材和中药制剂的仿鉴定和质量控制，那么我们就还必须要同时选择多种方洄法进行协同分析，比如分子珉标记技术与细胞学标记技术撒、生化标记技术、高效液相及核磁共振分析等技术的协艘同使用，通过多种技术的结瞄合来达到最终准确鉴定中药妁材或中药复方制剂的目的。忻【参考文献】1刻黄璐琦,王敏，周长征，等.RAPD方法在细辛类药品材鉴别研究中的问题及对策残J.药学学报，199飙8，33(10)：778.2黄璐琦，王敏，杨滨，等用随机扩增多态DNA(RAPD)技术鉴唰别中药天花粉及其类似品J药物生物技术,19呙99，19(4)：233廖.3王培训，黄丰，锾周联,等商品西洋参DNA指纹图谱鉴别J中吝
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20、干类中药J中草药璃，2002，33(10)：935.8胡珊梅牟,张启国,周涵韬，等RAPD法在金线莲的鉴别研鲷究中的应用J中草药灯，2002，33(10)：949.9党荣理溱，马永红，吴霞，等新疆晗产麻黄的RAPD分析J岌中草药，XX，34(舌9)：861.10砌ZhaoM，ChenM，牿WangN，eta1S帧tudyongeneticrelation-shipamongsomec厘ommercialstr曾ainsofGanodermaJJNaingAgriculturalUniversity，沈XX，26(3)：60.瞩11刘文生，朱建明愫，何斌,等中药材厚朴的频随机扩增多态性DNA指纹
21、图谱研究J中药材，钰XX，27(3)：164牮12周延清，景建别洲，李振勇，等利用RA滩PD和ISSR分子标记分首析地黄种质遗传多样性J遗传，XX，26(6)：922.13罗裒恒，王和勇，孙敏，等应用RAPD快速鉴别中药材噌海风藤及其替代品J中医药学报，XX，32(攻5)：33.14李熄颖，李劲平广藿香道地性漫的RAPD研究J现町代医药卫生,XX，22(13):2027.1涂5马小军，汪小全，肖培根，等.人参农家品种的A诚FLP指纹研究J.中爿国中药杂志,2000，2荪5(12)：707.瘩16罗志勇，周钢，周肆出倩，等AFLP法构建人刈参、西洋参基因组DNA指丹纹图谱J药学学报，既2000，
22、35(8)：6庚26.17虞泓，和萄锐，倪念春,等.石斛属4种植物的AFLP分析J瑛中草药，XX，35(7)：808.18谢渊,张小蕾,李毅,等.犭天麻AFLP分析技术体系荩的建立J.生物技术，矶XX，17：47.1棵9常楚瑞，邹佳宁,宋聚龟先,等.天麻扩增酶切片段訇长度多态性反应体系的建立尊J.贵阳医学院学报,尘XX，31:391.20邱英雄，傅承新,吴釜斐捷.明党参与川明参群体商遗传结构及分子鉴定的IS峰SR分析J中国中药螈杂志，XX，28(7)：屮598.21孙岳，李景鹏,金元昌,等南、鞒北五味子ISSR鉴别研究褂J中医药学报，XX堕，31(1)：29.22周俊亚，宾晓芸，彭圻云滔,等.
23、罗汉果ISSR镅PCR反应体系的建立酾J.广西师范大学学报,XX,22:81.2腺3宾晓芸,唐绍清,周俊切亚,等.金花茶遗传多样性的ISSR分析J.武桄汉植物学研究,XX，23(1)：20.24醇彭云滔,唐绍清,李伯林,等.野生罗汉果遗传多样性用的ISSR分析J.生滤物多样性,XX，13(1苍)：36.25周延煞清,景建洲,李振勇,等.迪怀区地黄遗传多样性的IS瞵SR鉴定J中草药，龟XX,36(2)：257坷.26沈洁，丁小余磔,丁鸽,等.铁皮石斛居群诫差异的研究ISSR指纹筏标记方法的建立与优化J哗.中国中药杂志,XX，猛31：291.27蛩周晔,王润玲,唐铖,等.艽ISSR法鉴定中药黄精与
24、戚卷叶黄精J.天津医科觏大学学报，XX，12：1伥78.28叶桂英,绳杨关全,梁国鲁,等.两种粑常用麦冬栽培品种的ISS名R分子鉴定J.亚太传统医药,XX，3：48.29魏丹红,徐红,王堀燕燕，等.金钗石斛遗传多样牲研究的ISSR-PCR反应休系建立与优化J鬃.上海中医药大学,XX翮,2l(4):65.萋30徐红,王燕燕,魏丹镤红,等.不同产地丹参药材搜的ISSR分析与鉴别J嵊.中药新药与临床药理,XX,18(6):454锃.31张君毅,郭巧驿生,杭悦宇,等.半夏ISSRPCR反应体系的建立及条件优化研究J.燃江苏农业科学,XX,2:磁154.32李磊,荪陈敏,张明,等.4种叶型椰性状半夏和掌
25、叶半夏的IS胼SR分析J.西南师范鲴大学学报,XX，33：8芗6.33关锰,白成嗔科,王苗之,等.正交设计桢优化山茱萸ISSRPC搞R反应体系研究J.陕捂西师范大学学报,XX，3琪2：80.34曹福盱亮,王国霞,李广平,等.馀银杏ISSR-PCR扩增漱反应体系的优化J.浙品江林学院学报,XX，25丈(2)：186.35刘晓静,王文泉,郭凌飞歉,等.益智ISSR-PC蛛R反应体系建立与优化J捆.生物技术,XX,18痈(3)：33.36张岳峰,万里翔，徐敏，等俯.乌头DNA的改良CTA埙B提取和ISSR检测J刹.湖北农业科学,XX，41：12.37马髌小军，汪小全,肖培根，等诹野山参与栽培参核糖体
26、D躐NA的ITS系列比较J.中国中药杂志,200榷0，25(4)：206.38蒋继宏，孟娜，曹咨小迎,等苏皖产大戟属药用植物rDNA的ITs序筛列分析J.中草药，X岷X，36(6)：90039丁平，方琴巴戟白天与常见混伪品的rDNA幡ITS序列分析及其分子鉴黹定J中草药，XX，耦36(6)：908.40刘春生，白根本，阎逛玉凝基于核DNAITS歧序列的细辛药材基源及分子梓鉴定研究J中国中药杂志，XX，30(5)：滤329.41徐红,李晓波,丁小余,等.中药黄草石斛rDNA-ITS序列分析J药学学报颡，2001,36(10)煅：777.42姬可娓平，李啸红，李应东,等.吨应用rDNAITS基因间
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28、型的相关她性分析J药学学报,忄2002,37(4)：304.45余永邦,蜷秦民坚，粱之桃,等不同词产区太子参的rDNAIT账S区序列的比较J植铥物资源与环境学报，2OO霾3，12(4)：1.石46曾明,马雅军,郑水粑庆,等.中药葛根及其近缘种的rDNAITS序列分析J中国药学杂志，隗XX，38(3)：173绺.47金成庸，陈建食伟，刘忠权,等.韩茵陈等3种药材基源rDNA内转蜇录间隔区的序列分析鉴定J.中西医结合学报,X羌X，2(1)：58.济48吴平,周开亚,徐璐埭珊,等.中药材龟甲的分子鉴定研究J.药学学报筵,1998，33(4)：麻30449王义权舰,周开亚，徐璐珊,等.中璃药材乌梢蛇及其混淆品的DNA序列分析鉴别J.药学学报，1999，34叽(1)：6750周延清.生物遗传标记与应弦用M.北京:化学工业徊出版社,XX：194.16 / 16