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1、硫酸钠对胰岛素淀粉样纤维化及其细胞毒性的作用第24卷第1期2012年1月化学研究与应】ChemicalResearchandApplicationVo1.24,No.1Jan.2012文章编号:1004.1656(2012)oi-0054-05硫酸钠对胰岛素淀粉样纤维化及其细胞毒性的作用陈云霞,谢富瑞2,谢庆斯,徐润杨2,吴胜男,曾成鸣h(1.陕西师范大学化学与材料科学学院,陕西西安710062;2.陕西师范大学生命科学学院,陕西西安710062)摘要:超过2O种人类疾病与蛋白质或者多肽淀粉样纤维化密切相关,探究影n向蛋白质的结构稳定性及其淀粉样纤维化的环境条件具有重要意义.本文采用牛胰岛素作
2、为模型蛋白质,研究了N%SO对蛋白质淀粉样纤维化的作用.实验结果表明,不同浓度的Na:SO4对胰岛素淀粉样纤维化过程具有不同的影响,低浓度条件下可促进纤维化,较高浓度可明显抑制淀粉样纤维的形成,更高的浓度则使胰岛素形成非纤维状聚集体.ANS荧光分析结果表明,所有浓度的N%SO均可减小胰岛素聚集体的表面疏水性,并导致聚集休对细胞膜的损害作朋降低.Na2SO,的上述作用可能与其改变蛋白质分子问的静电作用力及溶剂效应有关.关键词:牛胰岛素;淀粉样纤维化;硫酸钠;细胞毒性中图分类号:Q518文献标识码:AEffectsofsodiumsulfateontheamyloidfibrillationand
3、thefibrillarcytotoxicityofbovineinsulinCHENYunxia,XIEFurut,XIEQirsi,xuRunyang,WUShengnan,ZENGChengruing(1.CollegeofChemistryandMaterialScience,ShaanxiNormalUniversity,Xian710062,China;2.CollegeofLifeScience,ShaanxiNornlalUniversity,Xian710062,Cla)Abstract:Amyloidfibrillationofproteinorpeptidewasasso
4、ciatedWithnlorejhan20humandiseases.Itwasofsignificancetoexplorethephysicalandchemicalcircumstancesunderwhichthefibr|lmtmnofaproteinistriggeringandproceeding.Inthepresentstudy,theeffectsofsodiumSUIfateOtltheamyloidfibrillationandthefibriliarrytotoxicityofbovineinsulinhadbeeninvestigated.Theresutsdemo
5、nstratedthatsodiumsulfateplayedvariedroIcsorlinsuiinfibriliation,dependingontheconcentrationofthesaltapplied.Ia)wconcentrationofsodiumsulfateenhancedthefibrilfiwmation,vcht!erzkqhigbconcentrationofthesaltresultedinaninhibitionofthefibrilationOrtheformationofnnnfibrillaraggre垮tiesANSassaysht)wedthats
6、odiumsulfatedecreasedthefibrillarsurfacehydrophobicityandconsequentlythefibrilinducedmembranedamageswereattenuated,asdemonstratedbySDSPAGE.ThealterationsinsolvatiouandcJectrostaticOFCewerepossitlyinvolredinthen】liiDlceccS,fsodimnsulfate()ntheamyloidogenesisofjnsulinKeywords:Bovineinsulin;amyloidfibr
7、illation;sodiumsulfate;cytotoxicity近年来的研究显示,很多人类疾病,如AlzheimetS疾病,疯牛病,帕金森氏病,以及型糖尿病收稿日期:201lo425修回日期:2011-072s联系人简介:曾成呜(1957.),霹,教授主要研究方向,生物化学.等均与蛋白质或多肽由于错误折叠而形成淀粉样纤维有关.进一步的研究发现,一与疾病不相E.1nail:ctbengmingzengsllrlU.edu.CFI第1期陈云霞等:硫酸钠对胰岛素淀粉样纤维化及其细胞毒性的作用55关的蛋白质也可以形成淀粉样纤维,即淀粉样纤维化是所有蛋白质的共性.研究蛋白质淀粉样纤维形成的环境条件
8、和分子机制对于探索相关疾病的病因和治疗方法具有重要的意义.不同的蛋白质由于其氨基酸序列不同,其三维结构,稳定性及形成淀粉样纤维的条件也不一样.在生物体内,各种物质通过分子间的物理化学作用维持生命活动所需的动态平衡,其中的金属离子和酸根离子通过调节分子间的相互作用,使得生物大分子能够保持正确的结构,从而发挥正常的功能.如果这种平衡受到干扰或者破坏,一些大分子,如蛋白质分子就可能产生错误折叠而失去其生物功能,并可能生成具有细胞毒性的淀粉样纤维.众多的研究报道表明,一些无机离子,包括常见的金属离子和酸根离子,能够对蛋白质淀粉样纤维化产生重要影响.我们在之前的工作中,报道了一些无机盐对牛胰岛素和溶菌酶
9、【6淀粉样纤维化的影响,发现高价金属离子或者高价酸根离子组成的盐对蛋白质的淀粉样纤维化具有一定的促进作用,这种作用与所采用的盐的浓度有关.硫酸根离子由于其较强的Kosmotropic效应,能够改变水溶液中蛋白质的高级结构,是一些内源性物质促进蛋白质淀粉样纤维化的关键结构部分.所以,探索硫酸盐对蛋白质淀粉样纤维化的影响,对于深入理解蛋白质淀粉样纤维化相关疾病的分子机制具有重要意义.胰岛素是一种蛋白质类激素,由两条富含螺旋的短肽链组成,两链之间由二硫键联接,由胰岛B细胞合成.胰岛素是最具有淀粉样纤维化倾向的蛋白质之一j.本文以牛胰岛素作为模型蛋白,用荧光探针技术,电镜和电泳等方法探索硫酸钠对胰岛素
10、淀粉样纤维化的作用以及蛋白质聚集体的性质与其细胞毒性的关系.1试验部分1.1材料与仪器实验药品及试剂:牛胰岛素(Bovineinsulin),硫磺素(ThioflavinT;ThT),8一苯胺一1一萘磺酸(8-anilinonaphthalene一1一sulfonicacid;ANS)购自SigmaAldrich(美国),电泳相关试剂购自Solarbio公司,其它试剂均为国产分析纯试剂.实验仪器:LS-55型荧光分光光度计(PerkinElmer,美国),H-600透射电镜(Hitachi,曰本),3K一3O型冷冻离心机(Sigma,德国),MiniVE电泳系统(GEHealthcare,美国
11、).1.2样品制备胰岛素淀粉样纤维:胰岛素蛋白溶于HC1(pH1.5)水溶液,终浓度为1mg/mL,加入不同浓度的Na:SO,混合液在53(2水浴中孵育12h,每隔1h取1次样品,取出的样品保存在4冷藏柜备用.1.3ThT荧光检测ThT用磷酸盐缓冲液(20mmol/L,pH7.4)溶解,4保存.取1O胰岛素成熟纤维,30IxLThT加至Tfis/HCI(10mmol/L,pH8.0)溶液中,终体积为3mL,1hT的终浓度为10g.mol/L,振荡10S左右,用荧光分光光度计进行荧光测定,激发波长为440nm,发射波长为484llm.1.4ANS荧光检测配制1.0mmol/L的ANS溶液,在胰岛
12、素样品中加入一定量的ANS溶液使ANS与蛋白质的浓度比值为17:l.用荧光分光光度计检测ANS与蛋白结合后的400600nm范围的荧光变化,准确记录最大发射波长及其相应荧光强度数值.激发波长370nm.1.5透射电子显微镜成熟胰岛素纤维(浓度为1mg/mL)用水稀释,使其终浓度为0.5mg/mL,取l5L滴于镀膜铜网上,10min后用滤纸沿边缘吸干,滴加15L醋酸铀(2%)染色10min.透射电镜下观察纤维形态并拍照(电压80KV).1.6红细胞膜的制备取新鲜全血,离心分离红细胞,加入低渗磷酸盐缓冲液(5mmo/LNa2HPO4,pH8.0)中,4溶血1h.然后在28000g条件下离心20mi
13、n,弃去上清后用低渗磷酸盐缓冲液洗涤两次,得到乳白色的红细胞膜样品.定量膜蛋白,稀释至1.5mg/mL,一40cC存放待用.1.7电泳检测取2O成熟胰岛素纤维,与20红细胞膜混合,37C孵育30min,SDS.PAGE分离,考马斯亮蓝染色,脱色后用凝胶成像仪拍照.2试验结果2.1ThT荧光ThT是一种能与蛋白质或多肽淀粉样纤维的JB56化学研究与应用第24卷片层结构特异性结合的荧光探针,在440Fin波长激发条件下产生特征的荧光发射峰(A482Fim).在酸l生条件下,胰岛索具有较强的淀粉样纤维化倾向,随着折叠结构成分增加,其1hT荧光强度也相应增大,纤维到达成熟阶段时,ThT荧光强度达到最大
14、.如图1所示,胰岛素纤维的生长过程以S型曲线为特征,表明淀粉样纤维化是个成核一聚合的动力学过程J,在纤维开始生长以前的一定的时间内,ThT荧光较弱,此阶段被称为蛋白质淀粉样纤维化过程中的延迟期.之后出现ThT荧光突然增强的现象,直到荧光值达到一个稳定阶段,为纤维生长期.与只有胰岛素的样品相比,加入10mmol/L,20mmol/L的NaSO后,胰岛素纤维的生长时间缩短;而加人50mmol/LNaSO后,胰岛素纤维的生长时间延长,加入100mmol/LNaSO后ThT生长曲线呈不断上升趋势.说明10mmol/L,20mmol/LNaSO对胰岛素纤维生长具有促进作用,50retool/LNaSO对
15、胰岛素纤维的生长具有抑制作用.而在100mmol/LNaSO的作用下,胰岛素分子的聚集行为发生了变化,产生的聚集体形态无淀粉样纤维特征,但ThT荧光不断增强,说明聚集体的二级结构仍然以折叠为主.图1ThT荧光检测胰岛素在Na:s0存在下的淀粉样纤维化过程胰岛素;O胰岛素+10mmol/LN%SO;胰岛素+20mmol/LNa2SO4;胰岛素+50mmoL/LNa2SO4;胰岛素+100mmol/LNa2SO4Fig.1ThTanalysisofamyloidfibrillationofbovineinsulininthepresenceofNa2SO42.2ANS荧光ANS是用于检测蛋白质疏水
16、区暴露程度的一种荧光探针,在与蛋白质的疏水区域结合后,其荧光强度增强,发射波长可能出现蓝移J.如图2所示,胰岛素在形成淀粉样纤维后,ANS荧光强度增加,即表面疏水性加强;随着溶液中Naso,的浓度增加,成熟胰岛素纤维和聚集体的表面疏水性呈下降趋势.最大发射波长变化不大,无明显蓝移.说明在Nas0存在的条件下,虽然胰岛素仍然能够形成纤维,但形成的纤维的表面疏水性降低,这可直接导致在与细胞作用时,不能进入细胞膜的疏水层,从而使纤维的细胞毒性也降低.Sodiumsulfate(mM)图2N%SO对成熟胰岛素(BI)淀粉样纤维ANS荧光的影响Fig.2EffectsofN%SO4ontheANSflu
17、orescenceofmatureinsulinfibrils2.3透射电镜成熟的胰岛素纤维在透射电子显微镜下呈密集纤维状,在较低浓度NaSO存在的条件下,形成的纤维变短;当Na2sO4浓度达到100mmol/L时,产生的胰岛素聚集体无淀粉样纤维特征(图3),说明Na:s0能够改变胰岛素聚集体的形貌.图3胰岛素聚集体的透射电镜图(A.典型的胰岛素成熟纤维;B.20mmol/LN%SO溶液中形成的胰岛素纤维;C.100mmol/LN%SO溶液中形成的胰岛素聚集体)Fig.3Transmissionelectronmicroscopyimagesofinsulinfibrilsandaggrega
18、tes2.4SDSPAGE结果蛋白质在形成淀粉样纤维后,可产生细胞毒性,如导致细胞膜通透性增大,诱导氧化胁迫及导O50一l1.时一uu=uu.1o一工_1.一.第1期陈云霞等:硫酸钠对胰岛素淀粉样纤维化及其细胞毒性的作用57致细胞骨架蛋白交联等等JD1j.本文采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPJGE)技术检测胰岛素纤维对细胞膜蛋白的作用.结果显示,胰岛素在形成淀粉样纤维后,能够诱导细胞膜蛋白聚集,在高分子量区域出现聚集带,如图4泳道4箭头所示.而在Na:SO存在的条件下,形成的淀粉样纤维和聚集体对膜蛋白无明显作用(图4泳道58).说明Na:SO在改变胰岛素聚集体形貌的同时,也降低
19、了胰岛素聚集体的细胞毒性.样化特征.在本文的实验条件下(pH1.5,53),胰岛素可在6h左右形成成熟淀粉样纤维,纤维形态具有密集的网状结构.由于胰岛素在形成纤维后,表面疏水性增强,可诱导细胞破裂和细胞膜蛋白聚集,具有细胞毒性.在NaSO.存在的条件下,胰岛素的纤维化过程发生较为复杂的变化.低浓度Na2SO可促进胰岛素纤维化,而较高浓度的NaSO则明显抑制淀粉样纤维的形成.胰岛素淀F3SDSPAGEpatternsoferythroeytemembranestreatedwithdifferentinsulinamyloidfibrils3讨论胰岛素是最具有淀粉样纤维化倾向的蛋白质之一,其天然
20、稳定构象主要为六聚体.在酸化条件下,胰岛素转变为单体,稳定性降低,容易通过自组装形成淀粉样纤维,纤维形态依条件不同而具有多参考文献:无论是低浓度还是较高浓度的N%SO,均可改变胰岛素的纤维化进程,同时也改变了形成的聚集体的形貌和降低了聚集体表面的疏水性,并降低了胰岛素聚集体的细胞毒性.NaSO的作用的多重性与其浓度密切相关.本文的结果为理解体内环境中无机离子在蛋白质淀粉样纤维化进程中的作用,探索蛋白质淀粉样纤维化相关疾病的分子机制提供了新的理论和实验依据.75:333-366.1ChitiF,DobsoncM.Proteinmisfolding,func:tionalamy-2HuangB,H
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