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1、-范文最新推荐- 能和Taq DNA聚合酶作用的蛋白质的筛选 摘要Taq DNA Polymerase是一种来源于嗜热菌Thermus aquaticus的高度热稳定的DNA聚合酶。是从Thermus aquaticus中分离获得了Taq DNA Polymerase并以其耐高温、较高的特异性、灵敏度等优良特性被广泛应用在PCR扩增中。热启动是在聚合酶链反应(PCR)中先将模板同引物在高于两者变性温度的条件下处理一段时间，然后再加入酶和其他成分进行扩增反应，用以消除非特异性扩增产物的方式。在较低温度时Taq DNA聚合酶和其它蛋白作用，酶作用降低，减少非特异性的PCR产物，只有当热(一般到90
2、以上)使蛋白和Taq DNA聚合酶作用解除后，才能进入PCR扩增的热循环。在以下的实验研究中，将会研究在反应中可与Taq DNA聚合酶作用的蛋白质，并且通过对于上述蛋白质的研究，从中筛选出能够作为和DNA聚合酶的作用蛋白质，通过反应时解除对于Taq DNA聚合酶结合作用，从而达到蛋白热启动的效果首先，运用基因工程手段将Avi-tag蛋白标签结合到到Taq DNA聚合酶尾端。Avi-tag蛋白标签的表达可以让宿主菌表达的Taq DNA聚合酶尾端出现15个氨基酸短肽标签方便Taq DNA聚合酶的提纯和筛选。其次用链霉亲和柱纯化该酶，利用SDS-PAGE电泳判断除吸附在链霉亲和柱上的Taq DNA聚
3、合酶外是否还有其它吸附的蛋白质。然后，通过混合不含Avi-tag标签的DNA聚合酶菌液和含有Avi-tag标签的DNA聚合酶菌夜，重复上述步骤来检测另外两种菌夜中是否含有和Taq DNA聚合酶作用的蛋白质最后，比较含有混合DNA聚合酶菌液和不含混合液的Taq DNA聚合酶在PCR反应中非特异性的改变，验证所筛选蛋白是否可以适用作为热启动蛋白。论文初步解决了筛选和Taq DNA聚合酶作用的蛋白质的实验操作流程，并且，做出了相关验证和理论猜想。9168关键词：PCR，Taq DNA聚合酶，链霉亲和柱，SDS-PAGE This paper has already worked out the ex
4、perimental operation process to how to purify the protein which is attached with the Taq DNA polymerase protein. Even more ,some guess and assume are pointed out to solve some foundational question.Key words: PCR, Taq DNA polymerase, Streptavidin column, SDS-PAGE目录一、绪论- 1 -1.1、PCR- 1 -12、Taq DNA聚合酶-
5、 2 -1.3、热启动- 2 -1.4常用蛋白标签- 2 -1.5、琼脂糖凝胶电泳- 3 -1.6、聚丙烯酰氨凝胶电泳- 4 -二、实验主要操作流程- 6 -2.1培养Taq DNA聚合酶工程菌pET29a-Taq-Avitag 菌株：Rosetta 高温菌：Thermus themphilus常温菌:E.coli DH5a- 6 -2.1.1、培养基及试剂- 6 -2.1.2试管培养- 7 -2.1.3摇瓶培养- 7 -2.2、 Taq DNA聚合酶的初步提取- 7 -2.3、用链霉亲和柱提纯标签蛋白- 8 -2.4. 检测Taq DNA聚合酶活性- 9 -2.5.利用琼脂糖凝胶电泳检测其它
6、蛋白质存在- 10 -三、实验结论和结果探究- 13 -四.实验展望- 15 -致谢- 16 -参考文献- 17 -一、绪论1.1、PCRPCR技术聚合酶链式反应英文全称(Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，有高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用与基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方聚合酶链式反应（Polymerase Chain Rea
7、ction，简称PCR）又用于无细胞子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。20世纪50年代分子生物学创立，在近60年的时间里，其理论与技术己渗透到生命科学的各个领域，极大促进了原有学科的发展，同时也派生出许多新的学科。如今，以分子生物学为核心的生物技术与微电子技术一起已成为21世纪的支柱产业。而作为生物工程产物的聚合酶链式反应技术的问世，又使分子生物学方法实现了惊人的转变，它己成为DNA实验室不可或缺的组成部分，正在现代分子生物学及与之相关的研究中发挥着重要作用。 Taq DNA聚合酶具有5′→3′核酸外切酶活性，但没有3′→
8、5′核酸外切酶活性，因此不具有3′→5′的校对活性。其错配率取决于dNTPs的浓度，会在PCR反应的3′末端加上额外的非模板链的核苷酸，通常为dATP。因此由Taq DNA聚合酶参与的PCR产物可以直接克隆到含有3′-T突出端的载体上。1.3、热启动在聚合酶链反应中先将模板同引物在高于两者变性温度的条件下处理一段时间，然后再加入酶和其他成分进行扩增反应，用以消除非特异性扩增产物的方式在聚合酶链反应(PCR)中先将模板同引物在高于两者变性温度的条件下处理一段时间，然后再加入酶和其他成分进行扩增反应，用以消除非特异性扩增产物的方
9、式。更好的PCR热启动方式是PCR反应混合物中含有抗DNA聚合酶的抗体，只有当热(一般到90以上)使抗体失活后，才能进入PCR扩增的热循环。1.4常用蛋白标签His-tag是蛋白纯化的标签His-tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，包括Ca2+、Mg2+、Ni2+、Co2+等，其中以镍离子使用最为广泛。镍琼脂糖凝胶FF的配基是最经典的IDA，镍离子有六个螯合价位，Ni-IDA螯合了三价，剩余三价，而Ni-NTA螯合了四价的，剩余是两价。因此，Ni-IDA琼脂糖凝胶作用力要比Ni-NTA琼脂糖凝胶的强。也正因为这个原因，IDA的载量要比NTA高，而在同样条件下Ni-IDA洗杂质和目标蛋白的
10、要比Ni-NTA的咪唑浓度高。但是NTA的填料更稳定，能耐受更强的还原剂，更不容易脱落。 Avi-tag——15个氨基酸残基组成的短肽标签Avi-tag是一个由15个氨基酸残基组成的短肽标签，在体内或体外都能被生物素连接酶在赖氨酸残基连接上一个生物素，从而实现蛋白的生物素化。而抗生物素蛋白或链霉亲和素可以专一地与生物素结合，正是基于这两个反应，Avi-tag技术可以应用于蛋白的固定、纯化和显影等。借助Avi-tag和生物素连接酶，基本上所有的蛋白质都能被有效的、特异性地标记上生物素标签。在体外试验中，BirA酶标记生物素的效率超过了95%。多功能复合标签蛋白标签是生命科学研究、产品开发等必不可少的工具。每种蛋白标签都有其适用的适用范围，通过不同标签之间的有效组合就能大大拓展蛋白标签的应用。例如His-Tag很适合蛋白纯化，但不能提高融合蛋白在E.coli中表达的可溶性，而将TrxTM、SUMO可以促进重组蛋白可溶性的标签与His-Tag一起组合，就可达到即提高可溶性重组蛋白表达，有便于纯化的效果，在获得纯化蛋白后，还可以通过SUMO蛋白酶高效地把蛋白标签去除。 能和Taq DNA聚合酶作用的蛋白质的筛选(4): 9 / 9