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1、1,特殊显微镜的使用（3）荧光显微镜的原理及其应用,一、实验目的： 掌握荧光显微镜的原理和使用方法 二、实验原理 荧光显微镜(fluorescence microscope) 是荧光显微术的基本装置。荧光显微术是利用一定波长的光（通常是波长短的紫外光和蓝紫光）照射被检样品，激发荧光物质发出可见的荧光。通过物镜和目镜的成像、放大，以供检视和拍摄。荧光显微镜具特殊光源，提供足够强度和波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光。视场中所见的像，主要是样品的荧光映像。,2,某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的光能形式辐
2、射出来，这种波长长于激发光的可见光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后可直接发出的荧光，称为自发荧光（如叶绿体中的叶绿素分子受激发所发出的火红色的荧光）；本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出的荧光称为次生荧光。常用的荧光染料包括丫啶橙、荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。 细胞内大部分物质经短光波照射后，可发出较弱的自发性荧光。有些细胞成分与能发出荧光的有机化合物荧光染料结合。激发后呈现一定颜色的荧光，借以对组织进行细胞化学的观察和研究。,3,2.1 荧光显微镜的基本装置及其光路 荧光显微镜因制造厂家、型号的不同，结构各异，但主要构件，基本相同。 2.1.1光源:采用高压汞灯
3、。汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳定。汞灯的构件，中间为一球形石英玻璃管，有两个钨电极，内充汞滴和少量氩氖混合气体。汞灯装在牢固的灯室中，有调中、聚焦和集光装置。使用中严禁频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭后，不能立刻点亮，经510min，汞灯冷却后再通电点亮。 HBO200汞灯的发射光谱为200600nm，其中在365nm和435nm处有两个高峰。,4,2.2.2滤色镜系统:荧光显微术的滤色镜，按用途或功能，主要分为下列两类： 激发滤色镜（exciter filter）:激发滤色镜的作用，在于为被检样品的荧光染料提供最佳波
4、段的激发光。荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值），利用滤色镜对光线选择吸收的能力，选用其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发高峰）的激发滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中，选择透过最宜波段的光线供用。 激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜（dichotic mirror）之间，物镜之前。滤镜的型号不同，数量较多，可按不同需要选用。,5,阻断滤色镜（barrier filter）:阻断滤色镜位于物镜之上，二向色镜和目镜之间，用以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长较短的光线，以防伤害眼睛，使荧光透过。选用的原则，以能完全阻断或吸收波长短于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧光。所以，阻断滤色镜的选
5、用，应视荧光染料的荧光光谱而定，以能最大限度地透过荧光和阻断短波光。,6,二向色镜（chromatic beam splitter）:荧光显微镜中，除上述两类滤色镜外，尚有一重要的分色镜系统二向色镜位于汞灯汞激发滤色镜构成的水平光轴与目镜和物镜构成的竖直光轴的两轴垂直相交处，斜向安装于光路之中。由镀膜的光学玻璃制成，其镜面方位与上述两光轴交角均呈45，兼有透射长波光线和反射短波光线的功能。在荧光显微术中承当色光的“分流”作用。,7,2.2.3荧光显微镜的光路 荧光显微镜的光学原理图根据照明方式的不同，荧光显微镜分为落射式荧光显微镜和透射式荧光显微镜两种。目前常用的是落射式荧光显微镜，特点是光源
6、通过物镜落射于样品，激发产生的荧光再通过物镜进入目镜。 透射荧光显微术光路:透射荧光显微术是激发光束通过聚光器自下而上的透射样品，诱发的荧光从物镜前方进入物镜。汞灯发出的强光经集光透镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发滤色镜、光路转换反光镜后光线转射向上，进入视场光阑，暗视场聚光器，进入样品，激发出的荧光射入物镜经阻断滤色镜进入目镜。,8,反射荧光显微术的光路:反射荧光又称落射荧光，因激发光由物镜后部进入物镜，向下落射样品，激发出荧光，荧光反射向上再进入物镜。其光路如图3-1和3-2所示。 汞灯发出高强的激发光，经集光透镜，吸热玻璃，孔径光阑，激发滤色镜，视场光阑，通过二向色镜，在此处一定波长以上
7、的长波光线透过二向色镜，脱离光路，一定波长以下的短波光线反射向下进入物镜，透过物镜射向样品，激发荧光物质发出可见的荧光，荧光反射向上再次进入物镜，复经二向色镜其中波长较短的光线反射至光源方向，荧光和长波光线透射向上经阻断滤色镜进入目镜。 荧光显微镜的光学原理见图3-3：,9,图3-1落射荧光显微镜光路图,10,图3-2落射荧光显微镜光路图,11,图3-3荧光显微镜的光学原理,12,荧光的种类,自发荧光（固有荧光）,二次荧光,13,荧光显微镜的类型,1、透射式荧光显微镜：激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上这是比较
8、旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱所以对观察较大的标本材料较好。,14,透射式荧光显微镜效果图,15,透射式荧光显微镜光路图,16,2落射式荧光显微镜：这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜(图26)。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片双色束分离器阻断滤片的组合插块
9、，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强,17,18,荧光显微镜内部构,19,落射荧光显微镜光路图,20,使用方法,(1)高压汞灯的调中：汞灯调中检验器似物镜状，使用时将其全部旋入物镜转换器，中部有一圆形屏，能映现汞灯的电弧像，用以观察调中。按通电源，按压启动钮，点亮汞灯。完全开放视场光阑和孔径光阑。转动汞灯室右侧的水平和垂直调中螺旋，通过调中器圆形屏观察，至调中器内部被充分照明止。旋转集光透镜调焦钮，使汞灯电弧像聚焦，再用调中螺旋将电弧像驱于水平对称位置（调中）。,21,(2)光吸收器的组装： 反射式荧光装置无需聚光器，由一底部封闭的
10、圆筒状的光吸收器取代，用以吸收射入的光线，防止四射。 组装方法：降下聚光器架，将光吸收器插入楔形神内，固紧、回升最高位。,22,(3)操作程序 转动镜臂旋转台，至相应的标志位。旋转台为一圆盘状结构，上有5个定位标志：U、V、B、G、O，分别代表不同的荧光激发方法及其不同的滤色镜系统组合。 点亮汞灯，接通电源，按压启动器按钮，使汞灯点亮。 将镜臂左侧的DIA转换钮调至EPI位。 确认汞灯点亮，照明系统正确，灯位调中，电弧像聚焦准确。 用荧光染料染色的样品，放在载物台上，用10物镜聚焦。 孔径光阑的调整使用：光阑位于镜臂中，用外露手杆操纵。在汞灯调中、聚焦时，光阑应全开。荧光显微时，孔径应缩小，使
11、之小于视场。,23,视场光阑的调整使用：视场光阑位于孔径光阑之后，亦由外露手杆操纵。视场光阑用于限定样品表面的照明区域，其开度一般应与孔径光阑的开孔相当。 辅助激发滤色镜滑动阀的使用:滑动阀位于镜臂专用槽中，可拉出或推入。有三个挡位供不同使用。全拉出位：供常规使用；中间位：用于激发法，辅助滤色镜进入光路；全推入位：用作光阀，阻断全光线 激发方法：共有四种激发方法：紫外、紫、蓝和绿激发法，各适用于各种不同的荧光染色方法。,24,观察,在演示台上的荧光显微镜下（用蓝紫光滤光片），可见经0.01的丫啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。,25,双重染色标本的单色和双色观察,