临床生化检验方法学评价试验.ppt

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1、1,贵阳医学院医学检验系黄海,实验 27 临床生化检验方法学评价试验,2,实验目的,掌握：方法学评价试验的原理和基本方法及统计分析 熟悉：方法学评价试验的具体操作。,3,一、重复性实验,二、回收试验,三、干扰试验,四、方法比较试验,五、方法性能决定图绘制,六、最低检测限实验,4,实验原理,批内重复性试验是指在同一条件下（用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变）对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。其结果能反映测定方法的随机误差大小。,一、重复性实验,5,试剂与器材,1. 标本 采用血糖浓

2、度约为6.7mmol/L的血清 标本（收集无溶血、无脂浊、无肝炎病毒 污染的人混合血清或动物血清）。 2. GOD-POD试剂盒。,6,操作步骤,将血清标本用GOD-POD法作5轮，每轮4次血糖测定，即可获得20个测定数据。,7,计算,1. 检验20次测定数据中的离群值 如存在异常值时应剔除。对小样本测定来讲，可采用Grubbs检验，该方法是最合理的检验方法。,8,计算,用Grubbs检验准则，检验离群值的统计学公式是：,式中，Xd为离群值； X为包括离群值在内的测定值的均数；s为包括离群值在内的测定值的标准差,9,如计算的G值大于系数表中相应显著水平的a和测定次数n时的临界值Ga.n，则将X

3、d作为异常值舍弃，可按下列三种情况来处理： （1）只有一个离群值的情况：设有n个测定数（X1X2X3X4Xn）其中X1为离群值，即可利用上述公式，直接对X1进行检验。,计算,10,（2）如果离群值是两个或两个以上，但都分布在均数X的同一侧，例如X1、X2都是离群值，则首先检验最内侧的一个数据（X2），即通过检验G2来决定X2是否应该放弃。如果X2应该放弃，X1自然也应该放弃。如果X2不应舍去，则再检验X1。但在检验X1时测定次数不应作为少了一次。,计算,11,（3）如果离群值有两个或两个以上。而且又分布于均数两侧，例如X1和Xn都属于离群值，则分别检验X1和Xn，是否应该舍去。如果一个数据决定

4、舍去，那么再检验另一个数据时，测定次数应该作为减少一次来处理；而且此时应该选择99%的置信水平。,计算,12,2. 按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均数(X)、标准差(s)和变异系数（CV%）。,（1）,（2）,式中为5 轮各次测定值的方差，即：公式,13,首先计算出每轮测定值的均数、标准差（Si）及方差S1、S2、S3、S4，并将数值填入表27-1内，再将5轮Si总和代入公式即可算出批内标准差Sw。最后计算出变异系数（CV%）,表27-1 批内重复性试验的数据处理,14,注意事项,血糖的医学决定水平值为2.8 mmol/L、6.7 mmol/L和8.9mmol/L。分析物浓

5、度应选择医学决定水平才更具价值。 2. 用于评价方法精密度的变异系数应该是剔除离群值后的计算结果。,15,评价,批内不精密度的判断限是1/4允许误差范围。 批间不精密度的判断限是1/3允许误差范围。 允许误差范围可以根据CLIA88规定的能力比对试验的TEa确定。,返回本实验目录,16,实验原理,二、回收试验,回收试验是用以发现分析方法比例系统误差的有效评价方法。 即通过测定GOD-POD法测定血糖的回收率，能较确切地判断该分析方法比例系统误差的有无或大小，从而评价方法的准确性。,17,试剂与器材,80mmol/L葡萄糖标准液 生理盐水 3. GOD-POD试剂盒 4. 血清标本 收集无肝炎病

6、毒、无溶血、无脂浊的人混合血清，先用GOD-POD法测定血糖浓度，再用生理盐水稀释血糖浓度至2.2mmol/L备用。,18,操作步骤,1.样品制备 基础样品：血清0.9ml+0.1ml生理盐水。 回收样品：血清0.9ml+0.01ml 80mmol/L葡萄糖标准液+0.09ml生理盐水。 回收样品：血清0.9ml+0.06ml 80mmol/L葡萄糖标准液+0.04ml生理盐水。 回收样品：血清0.9ml+0.09ml 80mmol/L葡萄糖标准液+0.01ml生理盐水。 2.血糖浓度测定 按GOD-POD法测定各制备样品的血糖浓度，每份样品作双份检测，结果取平均值,19,计算,1. 加入浓度

7、计算 2. 回收量计算 2. 回收率计算 将各项计算结果填入表27-2。,20,表27-2 回收试验的数据处理,21,注意事项,1. 标本加入标准液后，总浓度应在该方法的分析 范围内。最好使被测标本的浓度达到医学决定水 平，血糖测定的医学决定水平为2.8 mmol/L、6.7 mmol/L、8.9mmol/L。 2. 纯标准品溶液的加入体积不得超过血清样品的 10%，若稀释过大，误差将发生改变。 3. 准确加量是本试验最主要的技术关键。,22,评价,一般检验方法，要求回收率在95105%之间，最理想的回收率应为100%,返回本实验目录,23,三、干扰试验,实验原理,干扰试验是测定特异性和干扰两

8、者引起的误差。干扰物浓度一定时，产生的误差是恒定系统误差，误差的实际大小随干扰物的浓度而异。,24,三、干扰试验,实验原理,选用尿酸作GOD-POD法测定血糖的干扰试验，尿酸可疑和GOD反应生成的H2O2发生反应，使部分H2O2不能参与第二步POD的耦联反应，从而降低显色强度，产生负的测定误差。 尿酸对该反应有干扰，但不是尿酸被测定。 干扰试验既用于检测某方法的特异性，也用于检测干扰物质对方法的干扰作用，以评价分析方法的准确性。,25,试剂与器材,1. 血清标本 收集血糖浓度为6.7mmol/L的混合血清（要求同回收试验）。 2. 9.0mmol/L尿酸标准液。 3. GOD-POD试剂盒。,

9、26,操作步骤,1. 样品制备 基础样品：血清0.9ml+蒸馏水0.1ml 干扰样品：血清0.9ml+9.0mmol/L尿酸标准液 0.05ml+蒸馏水0.05ml 干扰样品：血清0.9ml+9.0mmol/L尿酸标准液0.1ml 尿酸样品：蒸馏水0.9ml+9.0mmol/L尿酸标准液0.1ml 2.GOD-POD法测定各样品血糖。,27,计算,1.干扰物加入值计算 2.干扰值计算 3.干扰率计算,28,将各项计算结果填入表27-3内,表27-3 干扰试验的数据处理,29,注意事项,1. 可疑干扰物浓度 加入可疑干扰物的浓度应明显高于通常所见浓度的上限，最好达到病理标本的最高值，尿酸升高的变

10、动范围在0.42mmol/L0.9mmol/L之间。 2. 干扰物对测定的影响与被分析物浓度无关，而与干扰物本身的浓度有关，所以产生的误差是恒定系统误差。 3. 其他注意事项与回收试验相同。,30,评价,偏差Bias允许误差（EA）的临界值，表明由于干扰物引起的偏差对临床诊断和治疗不产生不良影响，是可以被接受的。 血2.8mmol/、6.7 mmol/和8.9mmol/L时的EA为0.56mmol/L。,返回本实验目录,31,四、方法比较试验,实验原理,用两种方法同时检测一批样本，计算出两种方法间测定结果的差异，用以估计试验方法在检测样本时可能引入的误差。当选择准确度已知的常规方法作为比较方法

11、时，部分误差来自比较方法，其他部分误差则来自试验方法。若选择准确度高的参考方法作为比较方法，可把方法间的任何分析误差都归于试验方法。 本实验以HK法测定血糖的参考方法作对比来评价GOD-POD法测定血糖的总系统误差。,32,试剂与器材,1. GOD-POD法试剂盒 2. HK法试剂试剂盒 3. 血清标本40份 （其浓度尽可能覆盖线性范围）。,33,操作步骤,1. 取40份血清标本，每份标本用GOD-POD和HK两种方法，分别作双份测定。 2. 每次（天）测定8个标本，双份测定时第一次按顺序1，2.7，8，第二8，7.2，1，共测试5次（天）。并计算两法各自的测定结果。,34,计算,1. 将实验

12、结果作散点图，图中以x轴代表比较方法的测定值，y轴代表实验方法的测定值，在坐标纸上作图应散布于整个测定范围之内。 通过散点图可以观察到，测定数据的分布趋势，若所有测定值在坐标图中大致呈45角的直线分布，提示被实验方法与比较方法的测定结果之间存在密切的相关关系；若呈明显的曲线分布，虽然在统计学上可按照非线性资料处理，但在这种情况下，实验方法被采用的可能性极小。,35,计算,2. 如果x、y之间呈直线关系，可作直线回归的统计处理，计算： 回归方程y=a+bx和相关系数r。 其结果可以显示实验方法的测定结果有无系统误差存在。 截距a反映恒定系统误差的大小； 斜率b反映比例系统误差的大小； 相关系数r

13、反映两种方法相关性的密切程度。,36,在评价一个实验方法时，最理想的情况是回归直线呈45角通过零点，这时a=0，b（x/y比值）=1.0，表明恒定系统误差和比例系统误差均不存在。但x和y都会有随机误差，a和b只是估计值，会有所波动，只要偏离程度比较小，该方法就能用于临床检验的常规分析。,计算,37,3. 根据计算出的回归方程的a、b值，可以计算候选方法系统误差（SE）的大小，并与不同医学决定水平（Xc）的允许误差（EA）作比较，对被评价方法的系统误差的可接受性作出判断。SE的可接受性判断指标为,血糖测定的Xc=2.8 mmol/L、6.7mmol/L、8.9mmol/L时，Barnett提出的

14、EA值为0.56mmol/L。,计算,38,作相关分析 在方法比较试验中，相关系数（r）可作为被评价方法可否被接受的一项统计学指标。对相关系数还应作相关系数的t检验。 相关系数（r）的t检验统计学公式是：,计算,39,5. 方法比较试验的数据属于配对资料，因而可作配对t检验，其统计学公式是：,式中:d代表候选方法与参考方法测定值的差值(或正或负)； d为差值之平均值； n为配对数。,计算,40,在计算t值公式中的分子部分是两种方法的偏差值，表明方法间系统误差的大小。 分母是平均偏差标准误，反映方法比较实验中随机误差的大小。 因此t值时方法比较试验中系统误差和随机误差的比值。,计算,41,注意事

15、项,1. 选择试验样品 一般作40100例，包括常规工作中可能遇到的整个分析范围（其中25%的标本低于参考范围下限，50%标本在参考范围之内，25%标本高于参考范围），选择合适的样品分析范围比增加样品的数目更为重要。,42,注意事项,2. 试验方法 一般每个样品用两种方法各测一次，最好每个样品用两种方法各测定两次，在做双份第二次测定时，标本顺序应全部倒过来，最好在4h内完成。 3. 对比方法 对比方法的选择十分重要，一般应选参考方法或决定性方法，这样方法间的任何分析误差都可归于被评价的候选方法。,返回本实验目录,43,五、方法性能决定图绘制,实验原理,准确度和精密度是检测系统的两大最主要的性能

16、指标，二者结合就是总误差（total error，TE）。 当TE小于允许总误差（allowable total error，TEa）时，则检测系统的性能合格。 当TE大于TEa时，则检测系统的性能不可接受。,44,五、方法性能决定图绘制,实验原理,目前，有三种计算误差TE的方式 （bias代表不准确度，s或CV代表不精密度）： （1）TE=bias+2sTEa；或： TE%=bias%+2CV%TEa% （2）TE=bias+3sTEa；或： TE%=bias%+3CV%TEa% （3）TE=bias+4sTEa；或： TE%=bias%+4CV%TEa%,45,应用Westgard方法决定

17、图（method decision chart, MDC），将不准确度和不精密度以图像的形式表达，在图上与要求的质量作比较，结果简单明了。 根据以上几次的实验结果，应用MDC，可以对葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法)的性能作一综合性的评价。,五、方法性能决定图绘制,实验原理,46,操作步骤,1. 实验数据采用前面实验的结果。 重复性试验中得到的CV作为横坐标，然后利用方法比对实验中得到的回归方程y=a+bx，以重复性实验中标本均值为Y值，求出对应的X值，计算：,47,操作步骤,2. 取坐标纸，按图27-1所示作图。 首先确定分析质量要求，以总允许误差TEa表示。 本实验血糖的TEa是10%，在

18、坐标纸上定义y轴为允许不准确度（偏倚%），从0到Tea，最大刻度10%； 定义x轴为允许不精密度（%，即CV），从0到0.5 TEa，即最大刻度为5%。,48,从y轴的TEa（10）到x轴的0.5TEa（5.0）即过（0，10.0；5.0，0）两点画一直线，为偏倚+2s线。 从y轴的TEa（10）到x轴的0.33TEa（3.3）即过（0，10.0；3.3，0）两点画一条线，为偏倚+3s线。 从y轴的TEa（10）到x轴的0.25TEa（2.5）即过（0，10.0；2.5，0）两点画一直条线，为偏倚+4s线。 这三条分别把图划分成四个部分。 从上到下，分别代表性能差区、临界性能区、性能良好区和性

19、能优秀区。,49,3. 方法性能判定的不同水平结果 观察方法决定图上操作点的位置，判断方法性能。 四种可能分别为： 性能差，表明该测定方法不能满足质量要求，对于常规操作不能被接受。,操作步骤,50, 临界性能，表明该性能尽管能满足临床要求，但很可能失控，日常操作中，需要全面质量控制策略，增加训练有素的操作者，减少人员的轮转，增强仪器维护措施，小心监测病人检测结果，持续努力地改善方法性能。,操作步骤,51,良好，表明该测定方法能满足质量要求，在日常工作中，只要小心计划统计质量程序且能运用每批46个控制测定值的多规则质控方案，测定方法就能被很好地进行管理。 优秀，在日常工作中测定方法易于管理，只需

20、最少的花费，通常每批2个控制测定个数，单规则的质控方案就能很好的控制。,操作步骤,52,临界性能,性能差,性能优秀,性能良好,图27-1 允许总误差示意图,返回本实验目录,53,六、最低检测限实验,实验原理,选择合适的空白标本，该标本与待测标本的区别在于不含有待测物质。 事实上，除了药物测定外（因药物不存在正常体液中），其他空白标本只能近似于要求的条件。 一般用处理过的标本，如破坏或移除标本中的待测物，或用一般标本只是在分析步骤中省去关键的试剂或操作。 本试验采用后者，在GOD-POD法测血糖试剂中省去的GOD试剂，其他试剂不变，经多次测定，求出吸光度的均数和标准差，计算检出限。,54,试剂与

21、器材,在GOD-POD法测定血糖的酶混合液试剂中除去GOD，其他试剂的组成成分及浓度不变。,55,操作步骤,以蒸馏水作空白，取血清标本，用除去GOD的酶混合试剂，按GOD-POD法测血糖的操作步骤作20次测定，记录20次测定的吸光度。,56,计算,1. 计算20次测定的平均吸光度及标准差（s）， 其标准差即为低范围时的不精密度。 2. 检测低限计算 95%可能性 平均吸光度+2s 97.5%可能性 平均吸光度+3s,57,注意事项,最低检测限量可以表示实验方法的灵敏度。 但二者的概念不同，检测限反映了方法对空白样本测定的不确定度，是一种分析方法的最大检测能力的指标，更具实用性。 但灵敏度与取样

22、体积、分析方法及最后闭塞或检测需要量都有密切关系。,返回本实验目录,58,思考题,1. 重复性试验依据时间间隔可分为几种？哪种最符合临床实际？ 2. 重复性试验结果反映了什么误差？ 3. 计算变异系数为何要剔除离群值？ 4. 什么是回收率？回收率怎样计算？ 5. 为什么加入标准液的体积要控制在10%以内？ 6. 请简述干扰与特异性的概念，怎样用实验来加以区分？ 7. 干扰试验和回收试验的样品制备有何异同？ 8. 干扰试验反映的是何种误差？干扰率怎样计算？,59,9. 方法比较试验反映的是何种误差？比较方法为 何要用参考方法或决定性方法？ 10. 用于方法学比较试验的标本例数和浓度各有 什么要求？ 11. 做方法比较试验应注意哪些事项？. 12. 偏倚+2s、偏倚+3s、偏倚+4s线，三条线把 MDC分成哪几部分，每一部分分别代表什么 涵义？ 13. 什么叫检测限？最低检测限能反映方法的何 种性能？,思考题,60,谢谢！,返回总目录,