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1、第四章 基因克隆,1,基本概念 克隆:来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合 DNA克隆: 应用酶学的方法 体外进行 目的基因(各种来源的遗传物质)与载体DNA结合 将结合体转化/转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的细胞 扩增阳性转化细胞，提取目的基因，获取目的基因的大量拷贝 基因工程 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作,第一节 基因克隆中常用的工具酶,一. 限制性核酸内切酶,（一）命名 限制性核酸内切酶按其来源的微生物的学名加以命名。命名原则如下： 1. 限制性核酸内切酶第一个字母（大写 、斜体）代表该酶来源的微生物属名；第二、三个字母（小写 、斜体）代表微生物种名。 2. 接下来的字母代表微生
2、物的株或型。 3. 如果从一种菌株分离到几种限制性内切酶，则根据发现和分离先后顺序用罗马字母表示。如从流感嗜血杆菌(Haemophilius influenzae Rd)株中分离到几种酶，分别表示为Hind、Hind、Hind 等等。,2,（二）分类 根据限制性内切酶切割特性及催化条件分为、大类： 型，酶识别和切割位点不一致，一般在识别位 点之外0.40.7kb处随机切割。 型，酶切割位置在识别序列之外。 型，酶具有特异的识别及切割位置，在基因克 隆中广泛使用。,3,（三） 型限制性核酸内切酶的功能,催化dsDNA特定序列中磷酸二酯键的水解 （1）. 催化反应,5 A G C T 3 3 T
3、C G A 5,5-AG 3-TCp,pCT-3 GA-5,5 G G A T C C 3 3 C C T A G G 5,5-G 3-CCTAGp,pGATCC-3 G-5,5 G A G C T C 3 3 C T C G A G 5,5-GAGCT 3-Cp,pC-3 TCGAG-5,Alu ,BamH ,Sac ,（平末端）,（5端突出的粘性末端）,（3端突出的粘性末端）,4, 切口特征,切口为平端,5突出的粘端,3突出的粘端,如 Alu ,如 BamH ,如 Sac ,A G C T T C G A,G G A T C C C C T A G G,G A G C T C C T C
4、G A G, 酶解后 5-末端带磷酸基团 3-末端带羟基,5-G G A T C C -3 3-C C T A G G -5,5-G 3-CCTAGp,BamH ,pGATCC-3 G-5,7, 酶切割机率,若DNA链碱基呈随机分布,则：,识别4bp序列的酶 44=265 bp 识别6bp序列的酶 46=4096 bp 识别8bp序列的酶 48=65536 bp,8,微生物名称 酶名称 识别序列 产生的末端 同裂酶 同尾酶,Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC G BglMbo 解淀粉芽孢杆菌 BamHCCTAGG CCTAG-5 Bst Sau3A Xho,
5、Bacillus globigil AGATCT A 球芽孢杆菌 Bgl TCTAGA TCTAG-5 BamH,Escheria Coli R Y13 GAATTC G 大肠杆菌 EcoR CTTAAG CTTAA-5,Haemophilus influenzae Rf AAGCTT A 流感嗜血杆菌 Hind TTCGAA TTCGA-5 Hsu,Haemophilus influenzae Rf GANTC G 流感嗜血杆菌 Hinf CTNAG CTNA-5 FnuA,Providencia stuartii 164 CTGCAG CTGCA-3 普罗威奇登菌 Pst GACGTC G
6、 Sal p,Streptomyces albus G GTCGAC G 白色链霉菌 Sal CAGCTG CAGCT-3 AuaXho,部分限制性内切酶特性,9,（四） 特殊性质的限制性核酸内切酶,（1）同裂酶（异源同工酶） 来源于不同的微生物，具有相同识别顺序但切割位点可以相同，也可以不同的限制性核酸内切酶。,Hpa及 Msp,Sma,Xma,C C G G G G C C,C C C G G G G G G C C C,C C C G G G G G G C C C,10,（2） 同尾酶 此类酶来源不同，但识别序列与切割顺序具有相关性，一些酶的识别顺序包含在另一些酶识别顺序之中，它们作用
7、后能产生相同或相似的粘性末端。,Mbo,G A T C C T A G,BamH,Sam 3A,Bgl,G G A T C C C T A G,G G A T C C C C T A G G,A G A T C T T C T A G A,11,Sal,Xbo,G T C G A C C A G C T G,C T C G A G G A G C T C,-G -C A G C T,T C G A G- C-,-G T C G A G- -C A G C T C-,连接酶,12,（3） 远距离裂解酶 酶识别序列与切割位点不一致，但其切割距离是一定的。,Mbo,G A A G A C T T C
8、 T,切点在下游 8 bp 处,13,（4） 可变酶 酶的识别序列一般大于 6 bp ,其中有一个或几个核苷酸是可变的。,Dra ,C A C N N N G T G G T G N N N C A C,14,（5） 星号活力 限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，酶可切割一些与其特异识别序列类似的序列，以*号表示。,EcoR,EcoR*,G A A T T C C T T A A G,N A A T T N N T T A A N,15,（五）. 用途与注意事项,（1） 用途, 制作 DNA 物理图谱 DNA 限制性酶切片段长度多态性 （RFLP)分析 基因克隆及亚克隆 DNA 杂交与序列分析
9、 基因同源性研究 其它,16,（2） 注意事项, 20 0C保存，取出后仅短时间置冰浴中。 含Mg2+的 Tris-HCl 缓冲体系，含二硫苏糖醇 或巯基乙醇。 高盐（含 100 mmol/L NaCl ) 中盐（含 50 mmol/L NaCl ) 低盐（含 010 mmol/L NaCl ) DNA 溶液不能含有酚、氯仿、乙醚、过量的 EDTA 、SDS等。 通常加入510倍过量的酶。 酶的活性单位为：1小时内在50ul容积中使 1ugDNA降解的酶量,17,二. DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶 ,Klenow,Tag DNA聚合酶,18,1. DNA聚合酶,（1）活性,5 3D
10、NA聚合酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,19,（2）用途：经缺口平移标记DNA探针,21,5,3,双链DNA,dATP dCTP dGTP - 32PdTTP,*T,*T,3,5,*T,*T,*T,*T,3,3,3,3,3,3,5,5,5,5,5,5,5,3,DNA酶,大肠杆菌DNA聚合酶（全酶）,Mg2+,2. Klenow,DNA聚合酶 ,枯草杆菌蛋白酶,N 端小片段 具53外切酶活性 M=36,000,C 端大片段（Klenow） 保留 53聚合酶活性 35外切酶活性 M=76,000,22,（1） 反应,pC-pC-pG Gp-Gp-Cp-Tp-Ap-Tp-Cp-Gp-Ap
11、,53 聚合酶,dATP dCTP dGTP TTP,活性 反应 模板/引物或底物,单链模板； 带3-OH的引物,DNAOH + ndNTP DNA-(pdN)n + nPPi,23,+,Mg2+,pC-pC-pG-pA-pT-pA-pG-pC-pT Gp-Gp-Cp-Tp-Ap-Tp-Cp-Gp-Ap ,5,3,5,5,3,35 核酸酶,ssDNA,dsDNA,例：,Mg2+,pNOH,5,从3-OH端降解单链DNA和双链DNA；降解双链DNA的活性被53聚合酶活性阻断,Mg2+,（2） 用途, 修补 DNA 的 3 凹陷末端；, 标记 DNA 末端，以 32P dNTP 进行修补反应； 合
12、成第二条 cDNA 链； 用Sanger二脱氧系统测定 DNA 序列（Sanger等，1977）; 曾一度用于消化 3 突出末端，但近年来被 T4 DNA聚合酶 取代，后者的35外切酶活性较高。, pC-pCOH Gp-Gp-Ap-Ap-Tp-Tp,pC-pC-pT-pT-pA-pA Gp-Gp-Ap-Ap-Tp-Tp,Po的Klenow片段,dATP,TTP,Mg2+,例：,5,3,5,3,24-1,3. Tag DNA 聚合酶,特性：耐热，最适作用温度 7580 oC （60 oC活性为1/2，30 oC活性仅为1/10）,用途：PCR, DNA 测序等,24-2,三. DNA连接酶,1.
13、 活性与反应,活性 反应 底物, pA-pC-pG pA-pA-pT-pT-pC-pG-pT Tp-Gp-Cp - Tp-Tp-Ap-Ap Gp-Cp-Ap ,(a) 带有互补粘端的 DNA 分子，粘端的碱基彼此配对，使3-OH和5-磷酸靠在一起 (b) “缺口” DNA,ATP,Mg2+, pA-pC-pG-pA-pA-pT-pT-pC-pG-pT Tp-Gp-Cp-Tp-Tp-Ap-Ap-Gp-Cp-Ap,连接粘端,例：,5,3,3,5,OH,OH,25-1,活性 反应 底物,连接平端, pC-pG-pA pC-pG-pT-pA Gp-Cp-Tp Gp-Cp-Ap-Tp ,例：,高浓度的带
14、有3-OH和5-磷酸的平端双链DNA,OH,OH,5,3,3,5,ATP,Mg2+, pC-pG-pA-pC-pG-pT-pA Gp-Cp-Tp-Gp-Cp-Ap-Tp ,25-2,2. 用途,（1）通过粘端连接 DNA 分子。 （2）连接平端双链 DNA 分子，或连接平端 DNA 与合成接头。加入T4 RNA连接酶能提 高T4 DNA连接酶连接平端DNA分子的活力20倍左右。,26,四. 反转录酶,1. 活性与反应,活性 反应 模板/引物或底物,5 3 DNA聚合酶,RNA或DNA模板带有 3-OH 的RNA或DNA引物,DNA,RNA,OH,OH,ndNTP,DNA- ( pdN )n +
15、 nPPi,RNA- ( pdN )n + nPPi,或,Mg2+,或,27-1, pT-pT-pT-pT-pT Ap-Ap-Ap-Ap-Ap-Up-Cp-Up-Gp-Up-Cp-Cp-Up-Ap, pT-pT-pT-pT-pT- pA-pG-pA-pC-pA-pG-pG-pA-pT Ap-Ap-Ap-Ap-Ap-Up-Cp-Up-Gp-Up-Cp-Cp-Up-Ap,5 3 外切核酸酶 3 5 （RNase H ),专门降解RNADNA 杂合分子中的RNA, 能将RNA完全降解,dATP dCTP dGTP TTP,Mg2+,RNA,DNA,DNA,+ 寡聚核苷酸,5,3,3,5,5,5,OH
16、,OH,27-2,2. 用途,（1）合成 cDNA 的第一链或第二链，用于克隆 或分子杂交。 （2）标记带有 5 突出的 DNA ( 修补反应 ）。,28,五. 碱性磷酸酶,1. 活性与反应,此酶催化 DNA 、RNA 、核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸 脱掉5-末端磷酸。,活性 反应 底物,磷酸酯酶,pDNA,pRNA,或,5,5,-DNA,-RNA,OH,OH,5,5,单链 RNA 或双链 RNA 单链 DNA 或双链 DNA 核苷三磷酸 脱氧核苷三磷酸,31-1,2. 用途,（1）除去 DNA 或 RNA 的5-末端磷酸，然后用 32P标记 5末端 ; （2）除 DNA 片段的5-末端磷酸，以
17、防止自连接 作用。,31-2,六. DNA酶,34-1,DNA酶为一内切核酸酶。它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。产物为5端带磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在Mg2+存在下，DNA酶可独立地作用于每条DNA链，且切割位点随机分布。,Mg2+,p p p p p p OH,OH p p - p p p p p p,3,5,5,3,1. 活性及反应,在Mn2+存在下，DNA酶可在两条链的大致同一位置上切割DNA ( Melgar 和 Goldthwait,1968），产生平端DNA片段或者在单链突出端上只带有1-2个核苷酸的DNA片段。,p p p , p p ,Mn2+,5,
18、34-2,34-3,2. 用途, 用切口平移法进行放射性标记时，可用DNA酶在双链 DNA上产生随机切口。 在进行亚硫酸氢盐介导的诱变前，可用DNA酶在闭环DNA 上引入单切口以便将分子截短（Greenfield等1975）。 可用DNA酶建立随机克隆，以便在M13噬菌体载体上进行测序（Anderson,1981)。 可用DNA酶分析蛋白：DNA复合物（ DNA酶足迹法）（Galas和Schmitz,1978)。,第二节 基因克隆中常用的载体,必须有自身的复制子，能在宿主细胞内独立自主地进行 复制，并能使靶DNA片段一同扩增； 载体分子上必须有限制性内切酶位点即多克隆位点 （Multiple
19、cloning site, MCS),以供外源DNA插入，多种酶单一位点可以使载体在使用上具有 更大的灵活性； 载体应具有可供选择的遗传标志，包括抗药基因、酶基因、营养缺陷型及形成噬菌斑的能力等，以便于阳性重组体的筛选； 载体分子本身应尽量小，这样可容纳较大的外源DNA片段，并具有拷贝数高、易于与宿主DNA分离以及抗剪切力强等优点； 对于表达型载体还应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子等调控元件。,载体的作用及条件,34-4,一. 质粒,1. 质粒的结构与生物学特性,（1） 双链环状DNA （2） 自主复制 （3） 质粒的遗传表型及选择标志 （4） 质粒的可转移性 （5） 质粒的不
20、相容性,严紧型复制 松弛型复制,35,2. 常用的质粒载体,（1） pBR322,36,37,（2） PUC质粒,38,（3） 质粒载体的克隆步骤,39-1,39-2,表达载体 构建的表达载体应符合下述标准： 选择标志 强启动子 翻译控制序列和翻译起始点 多接头克隆位点 为便于分离纯化，可在目的基因前连接附加序列，表达融合蛋白。,原核表达体系：E.coli 优点： 培养方法简单、迅速、经济，适合大规模生产工艺。 缺点： 缺乏转录后加工机制，不宜表达真核基因组DNA 缺乏翻译后加工机制 表达的蛋白质常形成不溶性的包涵体 很难表达大量的可溶性蛋白,真核表达体系: 酵母，哺乳类细胞 优点： 可表达真
21、核基因组DNA 具备翻译后加工修饰机制 表达的蛋白质会恰当地分布在细胞内一定区域并积累 缺点： 操作技术难，费时，不经济,6,1. 融合蛋白表达载体,pGEX,47,2. 非融合型蛋白表达载体,pKK223-3,3. 分泌型表达载体,48,IN 系统,第三节 基因克隆的基本程序,一. 分离或合成外源基因,1. 直接从染色体 DNA 中分离,一些 DNA物理图谱已经确定，背景资料比较清楚的原核生物，可以采用直接分离法分离制备目的基因。从原核生物中提取纯化DNA 之后，根据它的限制性核酸内切酶物理图谱进行基因定位，便能很方便地从该 DNA限制性核酸内切酶消化片段的电泳凝胶上回收目的基因。但是，对于
22、真核生物 DNA 分子大，染色体数目多，采用直接法制备目的基因比较困难。,49,51,. 从 mRNA 合成 cDNA,目的基因可以通过纯化的 mRNA 经逆转录合成获得。例如网织细胞合成的蛋白质，90%是血红蛋白( Hb) 的、链。用抗Hb的抗体与网织细胞中分离出来的多聚核糖体一起保温，使多聚核糖体沉淀出来，再从其中可分离到Hb的mRNA。纯化mRNA的在逆转录酶催化下可以得到Hb的cDNA 。,51,3. 从基因文库(gene library)筛选,基因文库是指用重组DNA技术将某种生物细胞的总 DNA 的所有片段随机地连接到载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖构成各 DNA
23、片段的克隆，当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部遗传信息都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为该种生物的基因文库。因此，目的基因可以从基因文库中筛选获得。,52,4. 从 cDNA 文库中筛选,上述用某种生物体总 DNA 建造的文库，由于包含了该生物体的全套基因，因此它实际上是该生物基因组(genome)文库, 即gDNA文库。同样可有染色体基因组文库、叶绿体基因组文库、噬菌体基因组文库等文库。 如果把某种生物细胞全部 mRNA 抽提出来，再通过逆转录产生总 cDNA，用上述 gDNA 文库构建的方法，可以获得该种生物细胞的 cDNA 文库。由cDNA 文库也可以筛选出所需的目的基因
24、。 cDNA 文库与gDNA文库不同，它只包含表达蛋白质或多肽的基因，不包括内含子和其它不表达 的 DNA 序列。,53,5. 人工合成基因,一些简单的多肽（如生长抑制素，含14个氨基酸），可以在已知其一级结构的基础上，按这些氨基酸编码的核苷酸系列来合成基因。,54,55,6. PCR扩增目的基因,建立 gDNA 文库和 cDNA 文库，从文库中分离目的基因虽然有效，但都存在步骤多、费时、筛选工作量大等困难，而且更为重要的问题是往往不能获得完整的全长基因。PCR 技术可根据研究目的不同，既可选择以 DNA 为模板，通过扩增后得到含内含子和调控顺序在内的完整基因；又可选择以 RNA 为起始材料，
25、经逆转录成 cDNA，扩增后得到无内含子，无调控顺序，只有结构基因的核酸片段。通过 PCR 扩增可获得目的 DNA或其中某一特定顺序，用于亚克隆、酶切分析、建立 cDNA 文库或作为探针。PCR技术的诞生，使分子克隆中 DNA 操作变得更为快捷和准确。,二. 目的基因与载体重组,1. 粘性末端连接,同源互补粘性末端连接 非同源互补粘性末端连接 (定向克隆）, 同源互补粘性末端连接,连接效率高 两种方向 载体自身环化,56,同源互补粘性末端连接,利用碱性磷酸酶防止载体重新环化,64,非同源互补粘性末端连接 (定向克隆）,连接效率高 一种方向(定向克隆） 无载体自身环化,非同源互补粘性末端连接 (
26、定向克隆）,57,2. 平端连接,效率低 两种方向 多拷贝插入 可采取一定方法变为粘性末端连接： 人工接头连接 同聚物接尾,平端连接,58,EcoR ,5-GAATTC-3,3-CTTAAG-5,5-G,3-CTTAA,5-GAATT,3-CTTAA,5-GAATTCC-3,3-CTTAAGG-5,EcoR ,Hae ,5-GGCC-3,3-CCGG-5,CC-3,GG-5,酶切,填平,受体,供体,酶切,59,BamH ,5-GGATCC-3,3-CCTAGG-5,5-G,3-CCTAG,5-GGATC,3-CCTAG,5-GGATCCGA-3,3-CCTAGGCT-5,BamH ,Taq (
27、或Cla ),CGA-3,T-5,CGA-3,GCT-5,酶切,填平,受体,供体,填平,5-TCGA-3,3-AGCT-5,酶切,60,BamH ,5-GGATCC-3,3-CCTAGG-5,5-G,3-CCTAG,5-GGATC,3-CCTAG,5-GGATCGATCT-3,3-CCTAGCTAGA-5,Cla ,GATCT-3,A-5,GATCT-3,CTAGA-5,填平末端,连接,5-AGATCT-3,3-TCTAGA-5,Bgl ,填平末端,人工接头连接,61,同聚物接尾,62-1,三. 重组基因导入细胞,在基因克隆技术中，将质粒 DNA 及其重组体导入细菌称为转化( transfor
28、mation )；病毒及其重组体导入受体细胞称为转染( transfection )；噬菌体及其重组体导入受体细胞称转导( transduction )。,65,1. 氯化钙转化法, 感受态细胞,未经处理的大肠杆菌细胞对受纳重组分子不敏感，难以实现转化。当用理化方法诱导细胞，使细胞处于最适摄取和容忍外来 DNA 的生理状态感受态后，才有较高的转化频率，这种细胞称为感受态细胞( competent cell )。,66, 转化原理,细菌处于0oC氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42oC短时间热休克处理，促进细胞吸收
29、DNA 复合物。在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化子。,67,2. 电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌进入感受态，只依靠短暂的电击，促进 DNA 进入细胞。因其操作简单方便、转化率亦高，愈来愈为人们接受。,68,3. 体外包装转染法,利用噬菌体颗粒能够将自身DNA 有效地注入到寄生菌细胞内的原理，将噬菌体头部及尾部蛋白与 DNA 重组体混合，组装成完整的噬菌体颗粒，再来感染大肠杆菌。研究发现每微克重组 DNA 直接转染细菌，可产生103-4个噬菌斑；如用体外包装的具感染力的噬菌体颗粒，每微克可产生1
30、06个噬菌斑，比不包装裸露的重组 DNA 效率增加100倍。,69,70,4. 受体细胞的选择,受体细胞是重组基因增殖的场所。对受体细胞也应具有几个要求： 容易接纳重组分子； 对载体的复制扩增无严格限制； 不存在特异的内切酶体系降解外源 DNA； 不对外源 DNA 进行修饰； 符合“重组 DNA 操作规则”安全标准。,71,常用载体所用的宿主细胞,载体 宿主细胞 培养基,BR322 LE392 HB101 JM107 JM109 LB/ 抗菌素 pUC系列 JM103 LB/Ap 噬菌体 LE392 LB + MgSO4 M13 JM103 JM107 JM109 LB Charon LE39
31、2 C600 LB + MgSO4 EMBL3 LE392 LB + MgSO4 gt10 C600 hflA LB + MgSO4 pGEM JM105 JM109 LB/Ap gt11 Y1090 BNN97 LB/Ap + MgSO4,72,四. 重组体的筛选与鉴定,1. 抗生素平板筛选,利用载体的表型特征或遗传标记直接筛选。如：质粒、粘粒具有抗药性标记，它们转化宿主细胞后，都能在含有抗菌素 (Amp或Tet)的培养板上生长；而未转化的宿主细胞则不能生长。这样可从大量的细胞群体中筛选出转化子与非转化子。对于噬菌体来说，噬菌斑的形成就是他们自我选择的特征。对于重组子与非重组子的筛选则用:,
32、73,74-1,插入失活,插入失活,74-2, 插入表达,质粒 pTR262 携带有来自噬菌体 的 C基因，它是 Tetr 基因的负控制系统。在正常情况下，C基因表达产生阻遏物，使Tetr 基因不能表达，表现Tets 表型。如果在 C基因的 Hind 或 Bcl 位插入外源 DNA 片段，将导致C基因失活，Tetr解阻遏而表达，这时即表现Tetr表型。由这样的重组 DNA 转化细胞，在Tet平板上可以生长，而未消化或自身成环的质粒转化细胞及未转化细胞是不能生长的。,75, -半乳糖苷酶显色反应,UC 系列、pEGM 系列、M13 中引入了编码 LacZ 基因的肽顺序，其中含有多克隆酶切位点。当无外源基因片段插入时，质粒表达肽，它与宿主菌编码 N-末端-多肽缺陷的-半乳糖苷酶多肽发生基因互补，形成有活性的-半乳糖苷酶，在含有底物 X-gal 和诱导剂 IPTG 的存在下，菌落呈蓝色；如果LacZ 基因中插入外源基因，造成插入失活，使之不能产生多肽，转化细胞失去了-互补，将无-半乳糖苷酶活性存在，因此在X-gal 平板上，阳性重组子为白色菌落。,76, -互补筛选,77,2. 菌落杂交筛选阳性克隆,78,3. 限制性内切酶图谱鉴定:初步鉴定,79，80,4. 外源基因的序列分析： 鉴定阳性克隆的金标准,基因工程的基本程序,81,THE END,完,