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1、1,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量,2,SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物生物化学实验技术教学中一个重要实验之一。,3,能够带动生化实验技术综合型实验项目的开设。 如：蛋白质盐析沉淀提取 葡聚糖凝胶层析分离 DEAE-纤维素分离提纯蛋白质 蛋白质纯度鉴定、蛋白质分子量测定等。,4,一、实验目的,通过该实验使学生掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理； 掌握该技术的操作方法（基础性很强，使用范围宽阔； 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。,5,二、实验原理,带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。 区带电泳
2、是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。,6,区带电泳使用不同的支持介质，有滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。,7,（一）分类 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类： 1. 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。,8,2.不连续系统：由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳
3、。,9,（二）特点： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在 聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二 烷基磺酸钠）。,10,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。 蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，因此在进行电泳时，,11,蛋白质分子移速度取决于分子大小。当分子量在15000KD到200000KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。合下式： ，式中 将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行
4、电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,12,图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱,图2 电泳迁移率与logMW之间的关系,94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400,胶槽1,2,3,注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白,得到同行专家赞,13,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，必须完全打开蛋白质之间的二硫键，使蛋白质分子被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上。因此在用SDS处理样品同时用巯基乙醇处理。巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。,14,三、 实验试剂和
5、器材,材料 实验试剂 1.低分子量标准蛋白试剂盒: 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200l蒸馏水，置-20保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。,15,2. 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中 3. 10%SDS（十二烷基磺酸钠） 4. 1.5mol/L pH8.8 Tri
6、s-HCl缓冲液：称取Tris18.2g（PH计）,16,（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl（2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTr
7、is- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。,17,实验器材,垂直板电泳装置 直流稳压电源电泳厚胶浓度后要做8各小时，薄胶5各小时） 电泳仪 标准型酸度计（TLD80-2B） 离心机等,18,四、实验过程 如：免疫球蛋白G 分子量的测定 （一）血清-球蛋白的提取 硫酸胺盐析沉淀法 （二） -球蛋白脱盐纯化 葡聚糖凝胶过滤（柱层析法）除去硫酸胺，得到-球蛋白（去年完成的基金项目） （三）纯化免疫球蛋白G DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G。 （四） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定血液
8、免疫球蛋白G的分子量（ 连续四个单项实验）。,19,（1）制胶（简单叙述）（双层胶，摸索胶浓度） A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。 B.按比例配好分离胶，溶液立即倾入制胶模板中(1 5模板)，加少许蒸馏水，待胶凝固后，倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，样梳需一次平稳插入，静置40分钟，待模板中的胶定型后，轻轻取出梳形样品槽模具，梳口处不得有气泡，拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液。,20,C.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液, D.加样（摸索加样量） 取10l标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10l
9、2倍样品缓冲液，上样量为20l。 取10l样品溶液，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样量分别为5l 和10l。 E.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。,21,F.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在8mA，（电流、电压）当进入分离胶后改为16mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。 G.凝胶板剥离与染色 电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色 过夜。 H.脱色 染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色 。剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。,22,图1 标准蛋白质与待测样品电泳
10、图谱,图2 电泳迁移率与logMW之间的关系,五、实验结果分析,94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400,胶槽1,2,3,注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白,23,六、分析计算,绘制标准曲线：按下式计算 电泳迁移率 = 样品迁移距离/溴酚篮迁移距离 以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。,24,标准蛋白分子量（标准试剂盒）： 97400kD、66200kD、43000kD、 31000kD、20100kD、14400kD。 采
11、用不连续SDS-PAGE电泳法对所分离纯化的蛋白质进行纯度鉴定，发现图中电泳图谱可以清晰的看到两条蛋白带。,25,两条蛋白带代表绵羊免疫球蛋白G的重链和轻链。 计算分析结果表明： 绵羊血清lgG重链和轻链的分子量分别为50000和28000Kd。一般说来，当蛋白质的分子量在200000至15000 kD 之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系 。实验结果各谱带所代表的成分的分子量的范围均在此之间。用SDS-PAGE垂直板电泳测得绵羊血清具有一定的可信度 。,26,七、思考题,在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与
12、浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?,27,十二、达到预期目标 1. SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物生物化学实验技术教学中一个综合性实验项目， 且是一个较高水平的一个实验项目。,28,蛋白质盐析沉淀提取 凝胶层析分离（上年基金项目已完成） DEAE-纤维素分离提纯蛋白质 蛋白质分子量测定、生物分子纯度鉴定等综合项目（五个单项实验项目）。,29,2. 该项目的完成对我们课程的建设起到了促进发展的作用，达到了我们预期目标。,30,3. 该实验项目的开设，使学生掌握了利用聚丙稀酰胺凝胶电泳技术分离蛋白质 、SDSPAGE测定蛋白质分子量的基本理论及实验技术。,31,4. 通过对生物大分子的分离、纯化、鉴定等过程的学习，使学生在综合性实验技术方面 有了一个系统的认识及动手能力, 为在现代分子生物学技术等手段方面的运用打下了良好的基础。,32,5.“SDS 聚丙稀酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量”一实验的开设达到了与国内同类院校相当的较高水平。 对本科生的实验教学、本科生的论文设计、研究生的高级生化实验等方面都充实了内容。,