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1、授课：XXX,1,大肠杆菌的乳糖操纵子,授课：XXX,2,一、什么是操纵子模型,操纵子模型认为：一些功能相关的结构基因成簇存在，构成所谓的多顺反子（polycistron)，它们的表达作为一个整体受到控制元件（control element)的调节。控制元件由启动子、操纵基因（operator）和调节基因组成。调节基因编码调节蛋白，与操纵基因结合而调节结构基因的表达。如果调节基因编码的蛋白质与操纵基因的结合是阻遏基因的表达，这样的调控就称为负调控（negative control），相应的调节蛋白被称为阻遏蛋白（repressor);如果调节基因编码的蛋白质与操纵子基因的结合是激活基因的表达，
2、这样的调控被称为正调控（positive control），相应的调节蛋白被称为激活蛋白（activator）。,授课：XXX,3,二、乳糖操纵子的负调控,大肠杆菌的乳糖操纵子是第一个被阐明的操纵子。早在20世纪50年代，Jacob和Monod就开始研究大肠杆菌的乳糖代谢，集中研究乳糖对乳糖代谢酶的诱导（introduction）现象：如果供大肠杆菌生在的培养基中没有乳糖，那么细胞内参与乳糖分解代谢的三种酶，即-半乳糖苷酶（-galactosidase）、乳糖透过酶（lactosepermease）和巯基半乳糖苷转乙酰酶很少，如每个细胞的-半乳糖苷酶的平均含量只有0.55个。可是一旦在培养基中
3、加入乳糖或某些乳糖的类似物，则在几分钟内，每个细胞中的-半乳糖苷酶分子数量骤增，可高达5000个，有时甚至可占细菌可溶性蛋白的5%10%。与此同时，其他两种酶的分子数也迅速提高。由此可见，新合成的-半乳糖苷酶、透过酶和乙酰化酶由底物乳糖或其类似物直接诱导产生，乳糖及其相关类似物被称为诱导物。,授课：XXX,4,二、乳糖操纵子的负调控,Franois Jacob,Jacques Monod,授课：XXX,5,二、乳糖操纵子的负调控,如图：加入乳糖以后，1min内出现lac mRNA，稍后即产生-半乳糖苷酶和透过酶。当移去乳糖之后， lac mRNA总量立即下降，两种酶的活性却由于蛋白质半衰期较长
4、而在相当长的时间内维持稳定,授课：XXX,6,二、乳糖操纵子的负调控,授课：XXX,7,二、乳糖操纵子的负调控,-半乳糖苷酶主要催化乳糖分子内-糖苷键的水解，生成半乳糖和葡萄糖，还催化少量乳糖变成别乳糖的异构化反应，它由lacZ基因编码；透过酶是一种跨膜运输蛋白，负责将培养基中的乳糖运输到胞内，由lacY基因编码；乙酰化酶可催化乙酰基从乙酰辅酶A转移到-半乳糖苷上，由lacA基因编码，但其功能尚不知晓，因为缺乏乙酰化酶的突变体仍然可以利用乳糖。还有一种变体对诱导物没有反应。遗传作图表明上述变体的突变位点靠近lacZ、 lacY和lacA，被命名为lacI。,授课：XXX,8,二、乳糖操纵子的负
5、调控,为了确定这几种基因的关系， Jacob和Monod使用含有lacI、 lacZ、 lacY和lacA的F-质粒创建了部分二倍体的大肠杆菌，并进行了一系列互补实验，其中下图的两种突变对于操纵子模型的最终建立起了决定性的作用。,授课：XXX,9,二、乳糖操纵子的负调控,乳糖操纵子的调控模型,授课：XXX,10,二、乳糖操纵子的负调控,乳糖操纵子的调控模型主要内容：,1）乳糖操纵子由调节基因、启动子、操纵基因和三个结构基因组成，其中调节基因、启动子、和操纵基因构成控制元件，共同控制结构基因的表达。操纵基因位于启动子和结构基因之间，其核心结构是一段长位21bp的回文序列。 5 ATGTTGTGT
6、GGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAA3 3 TACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCCTT5,授课：XXX,11,二、乳糖操纵子的负调控,2)调节基因lacI编码阻遏蛋白，它独立表达，但由于是弱的启动子和终止子，阻遏蛋白在细胞内总是被维持在较低的浓度； 3）阻遏蛋白位四聚体蛋白，由四个相同的亚基组成。在无乳糖的情况下，它与操纵基因lacO结合而阻断RNA聚合酶启动结构基因的转录，但这种结合并不完全，因此会有微量的-半乳糖苷酶、乳糖透过酶和巯基半乳糖苷转乙酰酶的合成。,授课：XXX,12,二、乳糖操纵子的负调控,4）一旦高浓
7、度的乳糖进入细胞，在细胞内残留的-半乳糖苷酶催化下，一部分乳糖被异构化，变成别乳糖。而别乳糖作为别构效应物与阻遏蛋白结合，改变阻遏蛋白的构象，使其不能再与操纵基因结合，于是操纵子被打开； 5）RNA聚合酶与启动子结合，启动三个结构基因的转录，产生lacZ、lacY和lacA的共转录物，但翻译却是独立地进行，从而产生三种不同的酶； 6）由于阻遏蛋白与操纵基因的结合阻断结构基因的表达，因此，乳糖操纵子受到它的负调控； 7）发生在控制元件内的突变可影响到结构基因的表达。,授课：XXX,13,二、乳糖操纵子的负调控,他们都是高效诱导物，他们都不是半乳糖苷酶的底物，是一种人工合成的乳糖类似物，能够迅速和
8、持续地刺激乳糖操纵子结构基因的表达，它本身不能被降解，所以称他们为安慰性诱导（gratuitous inducer）.,授课：XXX,14,三、乳糖操纵子的正调控,乳糖操纵子除受到阻遏蛋白的负调控以外，还受到一种被称为分解物激活蛋白（catobolite activator protein,CAP)的正调控。正调控是在对大肠杆菌中出现的葡萄糖效应（glucose effect)进行的研究中发现的。葡萄糖的存在能够阻止大肠杆菌对其他糖类的利用，这种现象称为葡萄糖效应。 1965年，B.Magasonik等发现在大肠杆菌中也含有cAMP，而且它的浓度与葡萄糖浓度呈负相关。cAMP浓度的变化与腺苷酸
9、环化酶的活性直接相关联，即高浓度的葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性而导致cAMP浓度的下降。,授课：XXX,15,三、乳糖操纵子的正调控,人们通过大肠杆菌细胞膜的cAMP类似物-双丁酰cAMP加入到含有葡萄糖和乳糖的培养基中，结果发现乳糖操纵子被诱导，乳糖能够被利用了。这就说明cAMP浓度的升高是细胞能够利用乳糖的前提。 人们发现两类不能利用其他糖类的大肠杆菌突变体： 一类突变体的腺苷酸环化酶基因有缺陷，因此在任何情况下都不能合成cAMP；另一种突变体缺乏一种能够与cAMP结合的蛋白，即cAMP受体蛋白CRP或CAP，这种突变体在加入外源的cAMP后也不能利用乳糖。这说明cAMP是通过CAP起作用
10、的。,授课：XXX,16,三、乳糖操纵子的正调控,通过科学家的不懈努力我们终于知道： CAP由2个相同的亚基组成，每1个亚基含有209个氨基酸残基，有2个结构域，1个在N端，含有结合cAMP位点，另一个在C端，含有螺旋-转角-螺旋，负责与DNA结合。CAP必须与cAMP结合以后才有活性，一般只要结合一个cAMP就完全被激活。当cAMP与CAP结合以后，CAP的构象发生变化，致使其C端的螺旋-转角-螺旋采取合适的取向，从而能够识别DNA上的结合位点。,授课：XXX,17,三、乳糖操纵子的正调控,使用DNA酶-足印法得到了CAP-cAMP与DNA结合的特异性位点，由26bp组成，位于乳糖操纵子的启
11、动子紧靠35区域的上游，其一序列是一段不完善的回文序列TGTGA-N6-TCACA,该位点被称为CAP位点。 CAP-cAMP与CAP位点的结合可导致周围的DNA产生小的弯曲，致使自身能够与RNA聚合酶全酶的亚基的羧基端相互作用，从而有利于RNA聚合酶与启动子的结合以及DNA双螺旋的局部解链，最终促进了下游基因的转录。,授课：XXX,18,四、乳糖操纵子双重调控的意义,乳糖操纵子之所以要受到双重调控，有两个原因：一是使细胞能够优先利用葡萄糖，而优先利用葡萄糖对细胞来说是有益的，因为参与葡萄糖分解的基因均是持家基因，这样葡萄糖可以迅速的被分解，为细胞提供能量；第二个原因是lac启动子序列与启动子的一致序列相差较大，是一个弱启动子，而CAP-cAMP的激活就弥补了其启动子活性的先天不足。,19,Thank you!,