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1、互叶白千层的快繁技术摘要：为研究出一套完整的互叶白千层快繁技术体 系，以互叶白千层幼苗茎段为外植体，分别以诱导率、增殖 倍数、生根率为指标，采用正交试验对芽诱导培养基、丛生 芽增殖培养基、生根培养基进行优化。结果表明，最佳诱导 培养基为 MS+ 0.01%活性炭 +0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA ，诱导率为 82.8%；最佳增殖培养基为 MS+30 g/L 蔗糖 +0.25 mg/L 6-BA ，增殖倍数为 31 倍；最佳生根培养基为 1/2 MS+30 g/L 蔗糖+0.1 mg/L NAA ，生根率达 100%，移栽 30 d 后成活率达 80%以上。 研究结果为互
2、叶白千层的工厂化育苗 提供了技术参考。关键词：互叶白千层；快速繁殖；正交试验；芽诱导； 丛生芽增殖；生根中图分类号：Q945.51 文献标志码： A文章编号： 1002-1302 (2015) 03-0020-04 互叶白千层( Melaleuca alternifolia )为桃金娘科(Myrtaceae)白千层属 (Melateuca)常绿小乔木，原产于 澳大利亚的新南威尔士州和新西兰的部分地区1 ，是近年我国成功引进的高价值经济植物及绿化树种。互叶白千层对污 染物有很强的净化能力 2-4 ，可用于构建植物浮床 5 。互叶 白千层的新鲜枝叶和树干提取的精油俗称茶树油，可以高 效、无毒、无刺
3、激地杀死人体皮肤表面的真菌和细菌 6-9 ， 并对某些病毒也有抑制作用 10-11 ，是一种强效的抗菌剂 12-17 、杀虫剂18-20 、芳香剂21 、防腐剂 22 ，是不可多 得的天然保健医药材料，广泛应用于制药、日化、食品、香 料等行业。因此，种植互叶白千层具有巨大的生态和经济效、人益。目前，国内外对互叶白千层的研究主要集中在其精油的 提取、成分分析及作用等方面 23-24 ，而对利用组织培养技 术进行再生植株的研究较少，目前尚没有完整的快繁技术体 系。依据精油化学成分含量的不同， 互叶白千层分为 6种25 ， 其中仅松油醇 -4 型优良品种提取的精油成分满足国际标准 26 。为获得品种
4、优良的互叶白千层，使用种子繁殖多败育， 发芽率很低 27 ，且后代易产生变异，难以保持亲本优良性 状；扦插繁殖生根率虽高 28 ，但成活率较低 29 。组织培养 既可以保持亲本的优良性状，又可以将获得的优良株系快速 推广应用于生产，有望成为互叶白千层产业化育苗的主要繁 殖手段。本试验以互叶白千层茎段为材料，进行表面灭菌处理， 对诱导培养基、增殖培养基、生根培养基进行筛选，并对试 管苗驯化移栽，拟建立一套完整的互叶白千层快繁技术体 系，为互叶白千层的优株选育提供理论依据，为其工厂化育苗提供技术参考1 材料与方法1.1 材料互叶白千层为温室栽培植株，株高 20 cm ，由江西抚州 市森源生物科技有
5、限公司提供。1.2 仪器W-CJ-2FD 洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司生 产），LMQJ型立式灭菌锅（山东新华医疗器械股份有限公司 生产）， JY2002 电子分析天平 （精密科学仪器有限公司生产） ， JA1003N 电子天平（精密科学仪器有限公司生产） 。1.3 方法1.3.1 外植体的表面灭菌及预处理 培养 60 d 的温室种 植的互叶白千层幼苗，株高 30 cm ，在 20 cm 处去顶。 30 d 后，随机剪取 5 cm 的幼苗茎段，剪去部分叶片，用洗衣粉 液浸泡30 min，流水冲洗2 h; 70%乙醇处理30 s,无菌水洗 3次，然后用0.1% HgCI2处理3 min，
6、无菌水洗4次，待用； 去掉茎段顶部，剪取约 1 cm、含45个节点的茎段，接种 到诱导培养基中。为了降低酚类物质氧化褐变引起的生长抑 制，在第 3 天将茎段转接到新的培养基中。1.3.2 诱导培养基的优化 采用 3因素 4 水平 L16（43） 正交试验。各因素水平见表 1 。共 16 组固体培养基，每组 8 瓶，每瓶 5 个茎段； 30 d 后统计长芽的外植体数、芽数，并计算诱导率。诱导率的计算公式如下：诱导率=诱导出芽的外植体数*接种的外植体数X100%。1.3.3 增殖培养基的优化 采用 3因素 4水平 L16（43） 正交试验。各因素水平见表 2。共 16 组液体培养基，每组 16 瓶
7、，每瓶 5 个诱导出单芽的茎段； 60 d 后统计丛生芽数， 并计算增殖倍数。增殖倍数的计算公式如下：增殖倍数=丛生芽数+接种的外植体数X100%。134生根培养基的优化 采用4因素3水平L9 （34）正 交试验。 各因素水平见表 3。共 9组固体培养基， 每组 10瓶， 每瓶 5 个幼枝茎段； 30 d 后统计生根的外植体数，并计算生 根率。生根率的计算公式如下：生根率=生根的外植体数+接种的外植体数X100%。1.3.5 移栽 生根培养 30 d 后，将试管苗转移到室外炼苗，散射光光照培养1020 d,当组培苗抽高生长，木质化 程度加强时，即可移栽。取出试管苗，清洗根部，再用 0.1% 高
8、锰酸钾溶液消毒 30 s,自来水清洗除去残留的高锰酸钾， 然后把试管苗移栽至含基质（泥炭 ：KG-*3珍珠岩=1:KG-*31 ）的花盆里,遮阳网遮阳,将 1 L 的塑料饮料容器 底部剪掉，罩在试管苗上，保持幼苗周围湿润。 14 d后，遮 阳网部分移除，容器一侧抬起以露出植物。再过7 d后，遮阳网移除，移走容器。移栽 30 d后统计成活率。1.4 培养条件温度(25 ± 2) C,光照12 h/d ,光照强度2 5003 000 lx 。诱导培养基、增殖培养基和生根培养基的基础培养基均 为 MS 培养基，通过添加各种不同浓度的激素或蔗糖、 MS 成分减半进行优化；固体培养基中加 7.
9、0 g/L 琼脂，调 pH 值 为 5.8；液体培养基不加琼脂，不调节pH 值，实际测得 pH值为 5.2。2 结果与分析2.1 诱导培养基的优化互叶白千层茎段在诱导培养基上培养30 d,统计结果见表 4。极差分析表明， 3 个因素对互叶白千层芽诱导的影响 大小依次为： NAA> 活性炭 6-BA 。随着 NAA 浓度的增加， 诱导率呈下降趋势； 当活性炭浓度为 0.0 1 %、6-BA 浓度为 0.1 mg/L 、 NAA 浓度为 0.05 mg/L 时，诱导出芽数是 2.46 个， 诱导率是 82.8%。方差分析表明， 3 个因素对诱导率及芽数 无显著影响(表 5、表 6)。芽诱导主
10、要是已有芽原基在解除顶端优势之后的萌发。 本试验结果表明，不同培养基对外植体的诱导率及芽数无显 著影响，最佳诱导效果的培养基为：MS+0.01%活性炭+0.1mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA 。2.2 增殖培养基的优化互叶白千层芽诱导后在液体培养基中增殖培养60 d，增殖倍数的统计结果见表 7。极差分析表明，3个因素对互叶 白千层芽增殖的影响大小依次为： NAA>6-BA> 蔗糖。随着 NAA 浓度的增加，增殖倍数呈下降趋势，当 NAA 浓度为 0 时增殖倍数最高。随着 6-BA 浓度的增加，增殖倍数先增大 后减小，当 6-BA 浓度达 0.250 mg/L 时增殖倍
11、数最高，这可 能是由于低浓度的 6-BA 促进细胞分裂，而高浓度的 6-BA 则抑制细胞分裂。随着蔗糖浓度的增加，增殖倍数先增大后 减小，当蔗糖浓度达 30 g/L 时，增殖倍数最高。方差分析表 明（表8）, NAA对增殖倍数影响达显著水平（PvO.05）。互 叶白千层芽增殖的最佳培养基组合为： MS+30 g/L 蔗糖+ 025 mg/L 6-BA ，增殖倍数达 31 倍。List 等采用单因素试验获得的增殖培养基为 MS 固体培 养基+1.0 mg/L BA，培养时间为63 d,增殖倍数为5.5倍30。 De Oliveira 等同样用单因素试验获得的增殖培养基为 MS 液 体培养基+0.
12、25 mg/L BA，培养时间为 56 d，增殖倍数为118 倍3 1 。樊吉尤等用不同激素组合进行试验,结果表明较好 的激素组合是 0.8 mg/L 6-BA+0.01 mg/L 2 ，4-D，增殖倍数为 14.88 倍32。本研究通过正交试验，获得了最佳的增殖培养 基,增殖倍数达 31 倍,而且丛生芽较粗壮,呈深绿色（图1-C） ,结果显著好于已往报道。主要原因有： （1）互叶白千 层通常生长在沼泽中 33 ,喜酸性或微酸性土壤 34-35 ,本 试验使用的液体培养基, pH 值为 5.2,适合其生长； （ 2）以 往研究一般在培养基中仅添加 NAA ,本试验将其设定为因素 之一，结果表明
13、， NAA 与增殖倍数呈负相关，不加 NAA 的 第 6 处理的培养基效果最佳； （ 3）本试验使用的是液体培养 基，养分交换非常充分，营养物质可以更好地被吸收 31 。由表 7可知，第 8 处理的培养基中外植体的增殖倍数为 0，观察发现该组培养基中的外植体无明显生长，逐渐变成 褐色，可能原因是激素配比不利于芽的生长，同时液体培养 基中氧气含量比较低，外植体易发生缺氧坏死。2.3 生根培养基的优化生根培养 30 d 后，生根率统计结果见表 9。极差分析表 明，对互叶白千层生根率的影响大小依次是： NAA> 基本培 养基=IAA>蔗糖。由表9可知，所有培养基的生根率都在80%以上，第
14、 6 处理的生根率和根系发达程度最高。观察可知， 该处理试管苗根系发达，有 3 级根，一级根上生成粗细不同 的二级根，并且在粗二级根上形成三级根，各级根上均有少 量根毛；在以后炼苗时发现，这样的根系更加有利于移栽成 活。因此，最佳生根培养基是含 30 g/L 蔗糖、0.1 mg/L NAA 和 0 mg/L IAA 的 1/2MS 培养基。2.4 移栽 幼苗移栽是试管苗从实验室适宜生长环境到复杂外界 环境，并发生从异养到自养的转变过程。因此，移栽前要进 行炼苗，让试管苗更好地适应自然环境。在本试验中，经过 炼苗，幼苗的地上、地下部分均具有较强木质化，移栽成活 率达 80%以上；其中，茎部粗壮、
15、叶片浓绿、根系发达的幼 苗，移栽时更易成活。3 结论 通过正交试验得出互叶白千层外植体的最佳诱导培养基为 MS+0.01%AC +0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA ，诱导率 达 82.8%；最佳增殖培养基为 MS+30 g/L 蔗糖+0.25 mg/L 6-BA ，增殖倍数达 31 倍；最佳生根培养基为 1/2 MS+30 g/L 蔗糖+ 0.1 mg/L NAA ，生根率达 100%；移栽 30 d 后，成活 率达 80%以上。研究结果为互叶白千层的工厂化育苗提供了 科学依据。参考文献：1 Shabir G A. Method development and valid
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