生物制药工艺技术基础3.ppt

1、第二章第二章 生物制药工艺技术基础生物制药工艺技术基础第一节第一节 生化制药工艺技术基础生化制药工艺技术基础 由人体组织来源的生化药物具有疗疗效效好好，几乎无无副作用副作用的独特优点。但由由于于以以人人体体组组织织提提供供的的原原料料受受到到法法律律或或伦伦理理方方面面的的严严格格限限制制，因此有许多的生化药物已更多地采用生物工程技术生物工程技术 目前已生产应用的制品主要有血血液液制制品品类类、人人胎胎盘制品类和人尿制品类盘制品类和人尿制品类。动动物物来来源源的生化药物是天然生化药物的主主要要品品种种，它具有原料来源丰富、价格低廉，便于综综合合利利用用和和批批量生产量生产的优点。生物制药工艺技

2、术基础(3)但由于提供原料的动物种种族族差差异异较较大大，所以对原原料的品质料的品质和制品的质控制品的质控要比一般药物更为严格。植植物物来来源源的生化药物品种正逐年增加，如酶酶、蛋蛋白质白质 多糖和核酸多糖和核酸等。海海洋洋生生物物来来源源的生化药物是发展最快的一大类生化药物。海洋生物种类繁多，是丰富的药药物物资资源源宝宝库库，具有很大发展潜力。生物制药工艺技术基础(3)一、生物材料与生化活性物质一、生物材料与生化活性物质（一）生化制药的生物材料来源（一）生化制药的生物材料来源 供生产生生化化药药物物的生物资源主要有动动物物、植植物物、海海洋洋生生物物和和微微生生物物的的组组织织、器器官官、细

3、细胞胞与与代代谢谢产产物物。应用动动、植植物物细细胞胞培培养养与与微微生生物物发发酵酵技技术术也是获得生生化制药原料化制药原料的重要途径。基基因因工工程程技技术术与与细细胞胞工工程程技技术术和和酶酶工工程程技技术术更是开发生化制药资源生化制药资源的新途径新途径。生物制药工艺技术基础(3)1、动物脏器、动物脏器 以动动物物组组织织器器官官为原料可以综综合合利利用用制制备备100多多种种生化药品。动物组织器官的主要来源是猪，其次是牛、羊、家禽和鱼类等的脏器脏器。l）胰胰脏脏 胰脏是动物体内不可替代的实实质质性性腺腺体体之之一一。它兼有其他器官所没有的内内分分泌泌和和外外分分泌泌两种功能。2）脑脑

4、脑组织富含脂质。脑组织中脂脂类类占13.5，蛋蛋白质白质占810，还有少量黏多糖少量黏多糖 脑组织中的主主要要脂脂类类物物质质是脑脑磷磷脂脂、肌肌醇醇磷磷脂脂、神神经经磷磷脂脂、脑脑苷苷脂脂、神神经经节节苷苷脂脂和和胆胆固固醇醇。还有神神经经递质和多种神经肽递质和多种神经肽。生物制药工艺技术基础(3)（3）胃胃黏黏膜膜 胃是动物的消消化化器器官官，主要分泌消消化化液液、胃黏膜胃黏膜。（4）肝肝脏脏 肝脏是机体内最大的不可替代的实实质质性性腺腺体体，是机体的“生化反应器”。肝脏含有复复杂杂的的酶酶系系，已知肝脏酶达数数百百种种，有些是其他组织所没有或者含量极少的。如鸟鸟氨氨酸酸氨氨基基甲甲酰酰转

5、转移移酶酶仅存在于肝细胞的微粒体中。肝脏还含有不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸、磷磷脂脂类类和和胆胆固固醇醇。肝脏富有肝糖原及维生素肝糖原及维生素A、D、E、B12等。生物制药工艺技术基础(3)（5）脾脾脏脏 脾脏是体内最最大大的的免免疫疫器器官官，已用于生产的药物有脾脾水水解解物物，脾脾RNA和和脾脾转转移移因因子子。人脾混合淋巴因子制剂淋巴因子制剂对原发性肝癌具有良好疗效。（6）小小肠肠 小肠是消消化化和和吸吸收收的主要场所，含有丰富的淋巴组织和多种内分泌细胞淋巴组织和多种内分泌细胞。（7）脑脑垂垂体体 脑垂体是重要的内内分分泌泌腺腺体体，由两部分组成：脑脑垂垂体体（前前叶叶）包括远侧部、结节及中

6、间部；神经垂体（后叶）神经垂体（后叶）包括神经部及漏斗部。垂体激素垂体激素品种不少于10种种。（8）心脏）心脏 心脏含有丰富的糖原、激素和酶类糖原、激素和酶类。生物制药工艺技术基础(3)其其他他动动物物脏脏器器如如肺肺、肾肾、胸胸腺腺、肾肾上上腺腺、扁扁桃桃体体、甲甲状状腺腺、睾睾丸丸、胎胎盘盘、羊羊精精囊囊、气气管管软软骨骨、眼眼球球、鸡鸡冠冠等也都是重要的生物制药原料。2、血液、分泌物和其他代谢物 血液约占占体体重重的的610，血血液液中中水水分分占占80，干干物物质质占占20。血液资源丰富，可用于生产药品、生化试剂、营养食品、医用化妆品及饲料添加剂等。尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒尿液、胆汁、蛇

7、毒、蜂毒等也是重要的生物材料。生物制药工艺技术基础(3)3、海洋生物、海洋生物 海洋生物是开发防治常见病、多发病和疑难病药物的重要生物材料重要生物材料。主要有：（1）海海藻藻 海藻是海洋水水生生植植物物类类，分绿藻门、褐藻门、蓝藻门、红藻门、甲藻门等10门，共门，共10000多种多种。（2）腔腔肠肠动动物物 腔肠动物是原始多细胞动物，有有9000多种。多种。（3）节节肢肢动动物物 节肢动物门中的某些甲壳动物可供药用。甲壳动物有甲壳动物有25 000多种。多种。生物制药工艺技术基础(3)（4）软软体体动动物物 软体动物有有80 000种种，包括螺、蚌类和乌贼等。（5）棘棘皮皮动动物物 棘皮动物有

8、有6000多多种种，包括海星、海胆、海参。（6）鱼类）鱼类 鱼类有有20000多种多种，可制造多种药物。（7）爬爬行行动动物物 爬行动物多数为陆陆生生脊脊椎椎动动物物。海生的主要有海蛇、海龟等。（8）海海洋洋哺哺乳乳动动物物 用鲸鱼和海豚类的脏脏器器和和腺腺体体已制成多种药物。其他海海洋洋生生物物还有环环节节、海海绵绵、扁扁形形、纽纽形形、两两栖栖等也都是重要生物材料。生物制药工艺技术基础(3)4、植物、植物 药用植物品种繁多，除含有生生物物碱碱、强强心心苷苷、黄黄酮酮、皂皂苷苷、挥挥发发油油、树树脂脂、鞣鞣质质等等有有效效药药理理成成分分外外，还含有氨基酸，蛋白质、酶、激素、糖类、脂类、维生

9、素类等众多生化成分。由植物材料寻找有效生物药物已逐渐引起重视，品种逐年增加，以及各种蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂。生物制药工艺技术基础(3)5、微生物、微生物 微生物资源非常丰富，已研究的品种仅占自然界中微生物总总数数的的10左左右右。微生物的代谢物有1300多多种种，已大量生产的才近近百百种种。微微生生物物酶酶有有几几千千种种，已被应用的才几十种，可见其应用前景很大。（1）细菌）细菌 常用细菌发酵法生产发酵法生产。主要发展领域有：氨基酸氨基酸。有机酸有机酸。糖类。糖类。生物制药工艺技术基础(3)核苷酸类核苷酸类。维维生生素素。用细菌可制取多多种种维维生生素素如如VB1、YB2、VB6、烟酸、生物

10、素、烟酸、生物素等。酶酶。（2）放线菌）放线菌 放线菌是最重要的抗生素产生菌，己有的1000多多种种抗抗生生素素约约23产产自自放放线线菌菌。其代谢产物也是重要的生物制药资源。氨基酸。氨基酸。核苷酸类。核苷酸类。生物制药工艺技术基础(3)维维生生素素。利用放线菌可产生维生素B12、B族维生素、胡萝卜素、蕃茄素及食品染料。酶。酶。放线菌能产生众多品种的酶。（3）真菌）真菌酶酶有机酸有机酸。氨基酸氨基酸。核酸及其有关物质。核酸及其有关物质。维生素。维生素。促生素。促生素。多糖。多糖。生物制药工艺技术基础(3)（4）酵母菌）酵母菌维生素。维生素。蛋白质与多肽。蛋白质与多肽。核酸。核酸。6、开发生物新

11、资源、开发生物新资源（1）动动植植物物细细胞胞的的大大规规模模培培养养 利用动植物细胞大规模培养产生生物药品是细胞工程技术细胞工程技术的一大应用领域。（2）应应用用基基因因重重组组技技术术建建立立“工工程程菌菌”或或“工工程程细细胞胞”，使所需要的基因在宿主细胞内表达，制造各种生物活性物质，是生物制药工业的重要发展领域。生物制药工艺技术基础(3)（二）生物材料的准备（二）生物材料的准备1、生物材料的选择、生物材料的选择 生化药物生产原料的选选择择原原则则是：有效成分含含量量高高，原原料料新新鲜鲜、无无污污染染；来来源源丰丰富富、易易得得；原料产地较近，价格低廉；原料中杂质含量少，便于分离纯化便

12、于分离纯化等。（1）有效成分的含量）有效成分的含量 生物品种生物品种 根据目目的的物物的分布，选择富富含含有有效效成成分分的生物品种是选材的关键。生物制药工艺技术基础(3)合适的组织器官。合适的组织器官。另外动物的年年龄龄、性性别别、营营养养状状况况、产产地地、季季节节对活性物质的含量也有影响。植物原料要注意采采集集地地点点、季季节节，微生物原料要注意其对对数数生生长长期期时时间间与活性成分的关系与活性成分的关系。（2）杂质情况）杂质情况 选选材材时时，应避免与与目目的的物物性性质质相相似似的的杂杂质质对对纯纯化化过程过程的干扰。（3）来源）来源 应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，

13、最好能一物多用，一物多用，综合利用综合利用。生物制药工艺技术基础(3)2、生物材料的、生物材料的采集、预处理与保存采集、预处理与保存 生物材料采集时必须保证环境卫生符合要求，并尽力保持原材料的新新鲜鲜，防防止止腐腐败败、变变质质与与微微生生物物污污染。染。生物材料采摘选取后，必须快快速速及及时时速速冻冻，低低温温保保存存，防防止止生生物物活活性性成成分分的的变变性性、失失活活，酶酶原原提提取取要要及时进行，防止酶原激活转变为酶及时进行，防止酶原激活转变为酶。植植物物原原料料采集后可就地去去除除不不用用的的部部分分，将有有用用部分保鲜处理部分保鲜处理。收集微生物原料时，要及时将菌体细胞与培养液分

14、开，根据有效成分存在部位及时进行保鲜处理。根据有效成分存在部位及时进行保鲜处理。生物制药工艺技术基础(3)生物材料的保存方法生物材料的保存方法主要有：主要有：冷冷冻冻法法。本法适用于所有生物材料。一一般般先先速速冻后置于冻后置于40处低温保存处低温保存。有机溶剂脱水法有机溶剂脱水法，常用的有机溶剂常用的有机溶剂是是丙酮丙酮。防腐剂保鲜法防腐剂保鲜法。常用乙醇、苯酚乙醇、苯酚等。二、生化活性物质的提取二、生化活性物质的提取（）生化活性物质常用的提取方法（）生化活性物质常用的提取方法1、酸、碱、盐水溶液提取法、酸、碱、盐水溶液提取法 生物制药工艺技术基础(3)2、表面活性剂提取法与反胶束提取法、表

15、面活性剂提取法与反胶束提取法 表表面面活活性性剂剂分子兼有亲亲水水与与疏疏水水基基团团，分布于水水油界面油界面时有分散、乳化和增溶作用分散、乳化和增溶作用。生生物物提提取取常用的表表面面活活性性剂剂，其HLB多在1020之间。在适适当当pH及及低低离离子子强强度度的条件下，表表面面活活性性剂剂能能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。生物制药工艺技术基础(3)反反胶胶束束也也称称为为反反胶胶团团。反胶束是表面活性剂分散于连续的有机相中自发形成的纳纳米米尺尺度度的一种聚聚集集体体。反胶束系统反胶束系统作为液液萃取方法，更具选择性液液萃取方法，更

16、具选择性。此法的优点是使热热敏敏感感性性的，亲水蛋白质在一种近似水相的环境中被提取出来，最最大大限限度度地地保保持持了了蛋蛋白白质质的的生生物物活活性性，蛋白质通过中中间间反反胶胶束束从一个主体相中转移到另一个水相中，并在瞬间完成瞬间完成。生物制药工艺技术基础(3)3、有机溶剂提取、有机溶剂提取 用有机溶剂提取生化物质可分为固固液液提提取取和和液液液提取（萃取）液提取（萃取）二类。（1）固液提取）固液提取 在生物制药中常用的有机溶剂有甲甲醇醇、乙乙醇醇、丙丙酮酮、丁丁醇醇等等极极性性溶溶剂剂以以及及乙乙醚醚、三三氯氯甲甲烷烷、苯苯等等非非极极性溶剂性溶剂。极性溶剂既有亲水基团又有疏水基团，从广

17、义上说，也是一种表面活性剂。甲甲醇醇、乙乙醇醇、丙丙酮酮能同水混溶，同时又有较强的亲脂性，对某些蛋白质、类脂起增增溶溶作用作用，乙醚、三氯甲烷、苯乙醚、三氯甲烷、苯是脂质化合物的良好溶剂脂质化合物的良好溶剂。生物制药工艺技术基础(3)在选用有机溶剂时一般采用采用“相似相溶相似相溶”的原则的原则。丁醇在水溶液中解离脂蛋白的能力更强解离脂蛋白的能力更强。在生化物质提取前，有时还用丙酮处理原材料，制制成成“丙丙酮酮粉粉”，其作用是使材料脱脱水水，脱脱脂脂，使使细细胞胞结结构构松松散散，增加了某些物质的稳定性，便于贮存和运输。有机溶剂既既能能抑抑制制微微生生物物的的生生长长和和某某些些酶酶的的作作用用

18、也能阻止大量无关蛋白质的溶出阻止大量无关蛋白质的溶出，有利于进一步纯化。生物制药工艺技术基础(3)（2）液液萃取）液液萃取 液液液液萃萃取取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。影响液液萃取的因素主要有目的物在两相的分分配配比（分配系数比（分配系数）和有机溶剂的用量）和有机溶剂的用量等。生物制药工艺技术基础(3)溶剂萃取的注意事项：溶剂萃取的注意事项：（1）pH 在萃取操作中正确选择pH很重要。所以，酸酸性性物物质质在在酸酸性性条条件件下下萃萃取取，碱碱性性物物质质在在碱碱性性条条件件下下萃萃取取，对氨基酸等两性电解质，则采用pH在等电点在等

19、电点时进行提取较好。（2）盐盐析析 加入中性盐如硫酸铵、氯化钠等可以使一些生化物质溶解度减少，这种现象称作盐析盐析。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提提高高萃萃取取率率：盐盐析析作作用用也能减减少少有有机机溶溶剂剂在在水中的溶解度水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少水分含量减少。生物制药工艺技术基础(3)（3）温度）温度 一般在室温或低温下在室温或低温下进行萃取操作。（4）乳乳化化 液液萃取时，常发生乳乳化化作作用用。去去乳乳化化的的常常用用方方法法有：过过滤滤与与离离心心；轻轻轻轻搅搅动动；改改变变两两相相的的比例比例；加热；加电解质加热；加电解质；加吸附剂（如碳酸钙）

20、加吸附剂（如碳酸钙）等。液液萃取时溶剂的选择液液萃取时溶剂的选择要注意以下几点：（1）选用的溶剂必须具有较高选择性较高选择性。（2）选用的溶剂，溶质与溶剂要容易分离与回收。溶质与溶剂要容易分离与回收。生物制药工艺技术基础(3)（3）两种溶剂的密密度度相相差差不不大大时时，易易形形成成乳乳化化，选溶剂时应注意。（4）要选用无毒，不易燃烧的价廉易得无毒，不易燃烧的价廉易得的溶剂。4、双水相萃取法、双水相萃取法 双水相系统是两两种种亲亲水水性性的的聚聚合合物物都加在一个水溶液中，当超过某一浓度时，就会产生两相，两两种种聚聚合合物分别溶于互不相溶的两相中物分别溶于互不相溶的两相中。其操作是向水相中加入

21、溶于水的高分子化合物，如聚聚乙乙二二醇醇（PEG）或或葡葡聚聚糖糖，可以形成密密度度不不同同的的两两相相（有时甚至是多相），因两相都含有较多的水，所以称为双双水水相相，常用的双水相系统为PEG葡葡聚聚糖糖和和PEG无机盐无机盐两种，后者应用更广泛。生物制药工艺技术基础(3)一般认为，成相是由于聚聚合合物物之之间间的的不不溶溶性性，即聚聚合合物物分分子子的的空空间间阻阻碍碍作作用用，无无法法相相互互渗渗透透，不能形成均一相，从而具有相分离的倾向。如用等量的11的右旋糖酐溶液和0.36甲基纤维素溶液混合，静止后，产生两相，上上相相中中含右旋糖酐0.39，含甲基纤维素0.65，而下下相相中中含右旋糖

22、酐1.58，含甲基纤维素0.15。生物制药工艺技术基础(3)5、超临界萃取技术、超临界萃取技术 超超临临界界流流体体萃萃取取技技术术的优点是节能，对生化活性物质不不产产生生热热变变性性作作用用，可使用生生理理惰惰性性溶溶剂剂在低温下分离活性组分。当在某一温度和压力时，气气体体和和液液体体的的物物理理特特性性就会趋于相同。两相变为一相，此时称为临临界界点点，物质的临界点常数包括：临界温度、临界压力和临界密度。临界温度、临界压力和临界密度。如CO2的临界点分别为31.1、7.3MPa和和0.47gml，当温度和压力高于临界点值时，物质处于液体和气体的中中间间状状态态，在超临界状态下的流体称为超超临

23、临界流体界流体，超临界流体最常用的萃取剂是超临界流体最常用的萃取剂是CO2。生物制药工艺技术基础(3)超超临临界界流流体体的物物理理特特性性、传传质质特特性性通常介于液体和气体之间，适于作为萃取溶剂。超超临临界界流流体体具有与液体同样的凝凝聚聚力力、溶溶解解力力。密密度与液体比较接近度与液体比较接近。随着温温度度和和压压力力的连续变化，超临界流体扩扩散散系系数数接接近近于于气气体体，是通常液体的近近百百倍倍，超临界流体的黏黏度度大大大大低低于于液液体体的的黏黏度度，接接近近气气体体的的黏黏度度，有利于物质的扩散。超临界流体的溶溶解解力力与与其其密密度度有有很很大大关关系系，而密密度度又又受受到

24、到体体系系温温度度或或压压力力的的影影响响，所以压压力力或或温温度度的的变变化都会直接改变其溶解能力化都会直接改变其溶解能力。生物制药工艺技术基础(3)（二）提取效率（二）提取效率 提取时，总希望提提取取率率愈愈高高愈愈好好，但实际上这种“相转移相转移”的提取效率的提取效率不可能达到100。在生物材料中总要残留部分目的物，残残留留量量的多寡取决于所选择的溶剂系统的种种类类、用用量量、提提取取次次数数以及操作条件。在实际工作中，溶剂的用量有一定限量，所以一般用分次提取法予以弥补分次提取法予以弥补。一般生产上多多用用23次次提提取取。溶溶剂剂用用量量（L）为为生生物物材材料料的的25倍倍，少数情况

25、也有用1020倍倍量量溶溶剂剂作一次性提取。目的是节省提取时间，降低有有害害酶酶的作用。生物制药工艺技术基础(3)当提取物由固相转入液相或从细胞内转到细胞外时，提取率还与物物质质的的扩扩散散作作用用有关。为了提高提提取取速速度度，常采取一些措施，如增加材料的破破碎碎程程度度，进进行搅拌行搅拌，延长提取时间延长提取时间，提高提取温度提高提取温度。（三）影响提取效率的因素（三）影响提取效率的因素1、温度、温度 多数物质的溶溶解解度度随随提提取取温温度度的的升升高高而而增增加加。另外较高的温度可以降降低低物物料料的的黏黏度度，有有利利于于分分子子扩扩散散和机械搅拌和机械搅拌。应用有机溶剂提取生化成分

26、时，一般在较低的温度下进行提取，一一方方面面是是为为了了减减少少溶溶剂剂挥挥发发损损失失和和生生产产安全，另一方面也是为了减少活力损失。安全，另一方面也是为了减少活力损失。生物制药工艺技术基础(3)2、酸碱度、酸碱度 多数生化物质在中中性性条条件件下下较较稳稳定定，所以提取用的溶溶剂剂系系统统原原则则上上应避免过酸或过碱，pH一般应控制在49范范围围内。为为了了增增加加目目的的物物的的溶溶解解度度，往往往往要要避避免在目的物的等电点附近进行提取。免在目的物的等电点附近进行提取。巧妙地选选择择溶溶剂剂系系统统的的pH，不但直接影响目目的的物物与与杂杂质质的的溶溶解解度度，还可以抑抑制制有有害害酶

27、酶类类的水解破坏作用，防止降解防止降解，提高收得率。生物制药工艺技术基础(3)3、盐浓度、盐浓度 盐离子的存在能减减弱弱生生物物分分子子间间离离子子键键及及氢氢键键的作用力。稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用助溶作用。一些不溶于纯水的球蛋白在稀盐中能增加溶解度，这是由于盐离子作用于生物大分子表面，增增加加了了表表面面电电荷荷，使之极极性性增增加加，水水合合作作用用增增强强，促使形成稳定的双电层双电层，此现象称“盐溶盐溶”作用作用。多种盐溶液的盐溶能力既与其浓浓度度有有关关，也与其离离子子强强度度有有关关，一一般般高高价价酸酸盐盐的的盐盐溶溶作作用用比比单单价价酸酸盐盐的的盐溶作用强。盐溶作

28、用强。生物制药工艺技术基础(3)常用的稀盐提取液有：常用的稀盐提取液有：氯化钠溶液（0.10.15molL）；磷酸盐缓冲液（0.020.05molL）；焦磷酸钠缓冲液（0.020.05molL）：醋酸盐缓冲液（0.100.15molL）：柠檬酸缓冲液（0.020.05molL）。其中中焦焦磷磷酸酸盐盐的的缓缓冲冲范范围围较较大大，对氢键和离子键有较较强强的的解解离离作作用用，还能结结合合二二价价离离子子，对某些生化物质有保护作用保护作用。柠柠檬檬酸酸缓缓冲冲液液常在酸性条件下使用，作用近近似似焦焦磷磷酸盐酸盐。生物制药工艺技术基础(3)（四）提取方法的选择（四）提取方法的选择 生物材料及其目的

29、物与提取有关的一些性状包括溶溶解解性性质质、分分子子量量、等等电电点点、存存在在方方式式、稳稳定定性性、相相对对密密度度、粒粒度度、黏黏度度、目目的的物物含含量量、主主要要杂杂质质种种类类及及溶量解性质、有关酶类的特征溶量解性质、有关酶类的特征等。操作者可根据文文献献资资料料及及本本人人的的试试验验探探索索获得有关信息，在提取过程中尽量增增加加目目的的物物的的溶溶出出度度，尽可能减减少少杂杂质质的的溶溶出出度度，同时充分重视生物材料及目的物在提取过程提取过程中的活性变化活性变化。生物制药工艺技术基础(3)对酶酶类类药药物物的提取要防防止止辅辅酶酶的的丢丢失失和其他失失活活因素的干扰因素的干扰；

30、对蛋蛋白白质质类类药药物物要防止其高级结构的破坏（即变变性性作作用用），应避免高高热热、强强烈烈搅搅拌拌、大大量量泡泡沫沫、强强酸酸 强碱及重金属离子强碱及重金属离子的作用。多多肽肽类类及核酸类药物需注意避免酶的降降解解作作用用，提取过程中，应在低低温温下下操操作作，并添加某些酶酶抑抑制制剂剂；对脂脂类类药药物物应特别注意防防止止氧氧化化作作用用，减少与空气的接触，如添加抗氧剂，通氮气及避光抗氧剂，通氮气及避光等。生物制药工艺技术基础(3)在提取过程中，如蛋白质、酶及核酸类药物常采采用用下列保护措施下列保护措施。（1）采采用用缓缓冲冲系系统统 防止提取过程中某些酸酸碱碱基基团团的解离导致溶液p

31、H的的大大幅幅度度变变化化，使使某某些些活活性性物物质质变变性失活性失活或因pH变化变化影响提取效果。在生化药物制备中，常用的缓冲系统有磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液、柠柠檬檬酸酸盐盐缓缓冲冲液液、Tris缓缓冲冲液液、醋醋酸酸缓缓冲冲液液、碳碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等，所使用的缓冲液浓浓度度均均较较低低，以利利于于增增加加溶溶质质的的溶溶解性能解性能。生物制药工艺技术基础(3)（2）添添加加保保护护剂剂 防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受破坏，如巯巯基基是是许许多多活活性性蛋蛋白白质质和和酶酶的的催催化化活活性性基基团团，极极易易被

32、被氧氧化化，故提取时，常添加某些还原剂如半半胱胱氨氨酸酸、巯巯基基乙乙醇醇、二二巯巯基基赤鲜糖醇、还原型谷胱甘肽赤鲜糖醇、还原型谷胱甘肽等。其他措施如提取某些酶时，常加加入入适适量量底底物物以保保护护活活性性中中心心。对易易受受重重金金属属离离子子抑抑制制的活性物质，可在提取时添加某些金金属属螯螯合合剂剂，以保护活性物质的稳定性。生物制药工艺技术基础(3)（3）抑制水解酶的作用）抑制水解酶的作用 抑抑制制水水解解酶酶对对目目的的物物的的作作用用是是提提取取操操作作中中的的最最重重要要保护性措施之一保护性措施之一。如需要金金属属离离子子激激活活的的水水解解酶酶（如DNase）常加入EDTA或用柠

33、檬酸缓冲液或用柠檬酸缓冲液，使水解酶活力受到抑制使水解酶活力受到抑制。对热热不不稳稳定定的水解酶，可用热热变变性性提提取取法法，使酶失活。根据酶酶的的溶溶解解性性质质的不同，可用pH不同的缓冲体系提取，以减少酶酶的的释释放放或根据酶的最最适适pH，选选用用酶发挥活力最低的酶发挥活力最低的pH进行提取进行提取。最有效的办法是在提取时，添加酶抑制剂添加酶抑制剂。生物制药工艺技术基础(3)（4）其他保护措施）其他保护措施 为了保持某些生物大分子的活性，还要注意避免紫紫外线、强烈搅拌、过酸、过碱或高温、高频震荡外线、强烈搅拌、过酸、过碱或高温、高频震荡等。有些活性物质还应防防止止氧氧化化，如固固氮氮酶

34、酶、铜铜铁铁蛋蛋白白提取分离时要求在无无氧氧条条件件下进行，有些活性蛋白对冷冷、热热变变化化也十分敏感，如免疫球蛋白就不宜在低温冻结。所以提取时要根根据据目目的的物物的的不不同同性性质质，具具体体对待。对待。生物制药工艺技术基础(3)三、生化活性物质的浓缩与干燥三、生化活性物质的浓缩与干燥（一）生化活性物质的浓缩（一）生化活性物质的浓缩 生化活性物质提取液在进一步分离、提纯前，根据物料性能可采采用用不不同同方方法法浓浓缩缩，由于多数生化活性成分对热不稳定，因此常采用一些较为缓和的浓缩方法缓和的浓缩方法。1、盐析浓缩、盐析浓缩 用添加中中性性盐盐的的方方法法来使某些蛋白质（或酶）从稀溶液中沉淀出

35、来沉淀出来，从而达到样品浓缩的目的。最常用的中性盐是硫硫酸酸铵铵，其次是硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸钾等。生物制药工艺技术基础(3)2、有机溶剂沉淀浓缩、有机溶剂沉淀浓缩 在生物大分子的水溶液中，逐渐加加入入乙乙醇醇、丙丙酮酮等等有有机机溶溶剂剂，可以使生化物质的溶溶解解度度明明显显降降低低，从溶液中沉淀出来，这也是浓缩生物样品的常用方法。其优点是溶剂易于回收，样品不必透透析析除除盐盐，在在低低温温操操作作下下，对多种生物大分子较较为为稳稳定定，但对某些蛋白质或酶却易使它们变性失活易使它们变性失活，应小心操作。应用本法获得的浓缩物，为防止生物活性物质变性应尽快除去有机溶剂。尽快除去有机溶剂。生

36、物制药工艺技术基础(3)3、用葡聚糖凝胶（、用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩）浓缩 加入固体的干干葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶G25，缓慢搅拌30min，葡聚糖凝胶吸水膨胀，进行吸滤，生物大分子全部留在溶液中，如此重重复复数数次次，可在短时间内使溶液浓缩到l00ml，每次葡萄糖凝胶的加入量为溶液量的15为宜为宜，用过的葡聚糖凝胶经蒸蒸馏馏水水洗洗净净后，可用乙乙醇醇脱脱水水，干燥后重复使用干燥后重复使用。生物制药工艺技术基础(3)4、用聚乙二醇浓缩、用聚乙二醇浓缩 将待浓缩液放入透透析析袋袋内内，袋袋外外覆覆以以聚聚乙乙二二醇醇，袋内的水分很快被袋外的聚乙二醇所吸收，在极短时间内，可以浓缩几十倍至

37、上百倍几十倍至上百倍。5、超滤浓缩、超滤浓缩 应用不同型号超滤膜浓缩不同型号超滤膜浓缩不同分子量的生物大分子。生物制药工艺技术基础(3)6、真空减压浓缩与薄膜浓缩、真空减压浓缩与薄膜浓缩 真真空空减减压压浓浓缩缩在生物药物生产中使用较为普遍，浓浓缩缩的的目目的的是除去挥挥发发性性溶溶剂剂，保持物料的生生物物活活性性，如薄膜蒸发器便是其中一例。薄膜蒸发薄膜蒸发的进行方式有二：一是使液膜快速流过加热面液膜快速流过加热面而蒸发，另一是使物料剧烈地沸腾，产生大量泡沫，以泡泡沫沫的内外表面的内外表面为蒸发面进行蒸发，后一方法使用较普遍。生物制药工艺技术基础(3)生物制药工艺技术基础(3)（二）干燥（二）

38、干燥 干燥是使物质从从固固体体或或半半固固体体状状经经除除去去存存在在的的水水分或他种溶剂分或他种溶剂，从而获得干燥物品的过程。水分在干燥的物料中，有三种情况：即表表面面水水、毛毛细细管管中中的的水水与与细细胞胞内内的的水水。表表面面水水很容易通通过过汽汽化化除除去去。毛细管中的水毛细管中的水，由于毛细管壁的作用，较难除去。细细胞胞内内的的水水由于被细细胞胞膜膜包包围围封封闭闭，如如不不扩扩散散到到膜膜外外则不容易蒸发除去。生物制药工艺技术基础(3)干干燥燥速速度度在温温度度及及压压力力不不变变的的条条件件下下取决于液液体体到到达表面的速度达表面的速度。物质在空气中的干燥度，也常称为物质的平平

39、衡衡湿湿度度，在一定条件下是一个不变值。因此，除非改变大气的温度，湿度或压力温度，湿度或压力。干燥多用加加热热法法进行。常用的方法有膜膜式式干干燥燥、气气流流干干燥燥、减减压压干干燥燥等。此外，冷冷冻冻干干燥燥、喷喷雾雾干干燥燥以及红外线干燥以及红外线干燥等也常选用。生物制药工艺技术基础(3)1、减压干燥、减压干燥 减减压压干干燥燥是在密闭容器中抽去空气后进行干燥的方法，亦称真空干燥真空干燥。2、喷雾干燥、喷雾干燥 喷喷雾雾干干燥燥是流流化化技技术术用于干燥的最早方法。待干燥的物质先浓缩成一定浓度的液体。由于液体经喷雾后具有极大的表面，故能在很短时间内干燥，使受受热热时时间缩短间缩短，而且干燥

40、物为粉状粉状，不需粉碎即可应用。生物制药工艺技术基础(3)生物制药工艺技术基础(3)3、冷冻干燥、冷冻干燥 冷冷冻冻干干燥燥是在低低温温、低低压压条条件件下下，利用水水的的升升华华性能性能而进行的一种干燥方法。在预冻结过程中，制品的预冻有两种方式两种方式：其一是制品与干燥箱同时降温同时降温；另一种是待干燥箱搁板降温至40左左右右，再将制品放入。前者相当于慢慢冻冻，后者则介于慢慢冻冻与与速速冻冻之间。之间。生物制药工艺技术基础(3)冷冷冻冻干干燥燥机机系系由由制制冷冷系系统统、真真空空系系统统、加加热热系系统统、电电器器仪仪表表控控制制系系统统所所组组成成，主主要要部部件件为为干干燥燥箱箱、凝凝

41、结结器器、冷冷冻冻机机组组、真真空空泵泵组组和和加加热热装装置置等等（图图2 3）。）。生物制药工艺技术基础(3)生物制药工艺技术基础(3)四、生化活性物质的分离与纯化四、生化活性物质的分离与纯化1、生化制药工艺中分离制备方法的、生化制药工艺中分离制备方法的特点特点 生生化化分分离离技技术术包括：生生化化分分离离分分析析和和生生化化制制备备。前者主要对生物体内各组分加以分离后进行定定性性、定定量鉴定量鉴定。而后者则主要是为了获得生物体内某一单纯组分单纯组分。生物制药工艺中分离制备方法有下列特点分离制备方法有下列特点：（1）生生物物材材料料组组成成非非常常复复杂杂。其中有不不少少化化合合物物迄迄

42、今今还还是是未未知知物物，而且生物活性物质在分分离离进进程程中中仍处处于不断代谢变化中于不断代谢变化中，因此常无固定操作方法可循常无固定操作方法可循。生物制药工艺技术基础(3)（2）有些化合物在生物材料中含含量量极极微微，因此分离操作步骤多，不易获得高收率不易获得高收率。（3）生生物物活活性性成成分分离离开开生生物物体体后后，易易变变性性破破坏坏，必须十分小心地保护这些化合物的生生理理活活性性，这也是生物制药中分离、制备的难点分离、制备的难点。（4）生生物物制制药药中中的的分分离离方方法法几几乎乎都都在在溶溶液液中中进进行行，各各种种参参数数（温温度度、pH、离离子子强强度度等等）对对溶溶液液

43、中中各各种种组组分分的的综综合合影影响响常常常常无无法法固固定定，以以致致许许多多实实验验设设计计理理论性不强论性不强。实验结果常常带有很大经验成分经验成分。生物制药工艺技术基础(3)（5）为了保护目的物的生理活性及结结构构上上的的完完整整性性，生物制药中的分离方法多采用温温和和的的“多多阶阶式式”方方法法进行，即常说的“逐级分离逐级分离”方法方法。（6）生生物物产产品品最最后后均均一一性性的的证证明明与与化化学学上上纯纯度度的的概概念念不不完完全全相相同同，因生物分子对环境反应十分敏感，结结构构与与功功能能关关系系比较复杂，故对其均一性的评估常常是有条件的，只凭一种方法得到的纯纯度度结结论论

44、往往是片面的，甚至是错误的。生物制药工艺技术基础(3)2、生化制药工艺中分离制备方法的基本原理、生化制药工艺中分离制备方法的基本原理生物大分子分离纯化的主要原理分离纯化的主要原理是：（1）根据分分子子形形状状和和大大小小不同进行分离。如差速离心与超离离心心、膜膜分分离离（透析、电渗析）超超滤滤法法 凝胶过滤法。（2）根据分子电电离离性性质质（带带电电性性）的的差差异异进行分离。如离子交换法、电泳法、等电点聚焦法离子交换法、电泳法、等电点聚焦法。（3）根据分分子子极极性性大大小小及及溶溶解解度度不不同同进行分离。如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。（4

45、根据物质吸吸附附性性质质的的不不同同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法吸附层析法。生物制药工艺技术基础(3)（5）根据配体特异性配体特异性进行分离亲和层析法亲和层析法。3、分离纯化的基本程序和实验设计、分离纯化的基本程序和实验设计 生物体内某一组分，特别是未知结构的组分的分离制备设计大致可分为五个基本阶段五个基本阶段：（1）确定制制备备物物的研研究究目目的的及建立相应的分分析析鉴鉴定定方法方法；（2）制备物的理化性质和稳定性的预备试验理化性质和稳定性的预备试验；（3）材料处理及抽提方法的选择材料处理及抽提方法的选择；生物制药工艺技术基础(3)（4）分离纯化方法的摸索；）分离纯化方法的摸索；（

46、5）产物的均一性测定均一性测定。提取是分离纯化目的物的第一步，所选用的溶剂应对目的物具有最最大大溶溶解解度度，并尽量减少杂质进入提取液中，为此可调整溶剂的pH、离离子子强强度度、溶溶剂剂成成分配比和温度分配比和温度范围等。分分离离纯纯化化是生化制备的核核心心操操作作。所以合理的分离纯化方法是根据目目的的物物的的理理化化性性质质与与生生物物学学性性质质依具体实验条件而定。根据分析和预试验的初步结果，参参考考别别人人对对类类似似物质的分离纯化经验物质的分离纯化经验，也可以少走弯路少走弯路。生物制药工艺技术基础(3)4、分离纯化方法步骤优劣的综合评价、分离纯化方法步骤优劣的综合评价 每一个分分离离纯

47、纯化化步步骤骤的的好好坏坏，除了从分分辨辨能能力力和和重现性重现性二方面考虑外，还要注意方法本身的回收率回收率。5、制备物均一性的鉴定、制备物均一性的鉴定 一个制备物是否纯，常以“均均一一性性”表表示示。均均一一性性是指所获得的制备物只具有一种完完全全相相同同的的成成分分。均一性的评价常须经过数种方法的验证数种方法的验证才能肯定。生物制药工艺技术基础(3)如果某物质所具有的物物理理、化化学学各各方方面面性性质质经过几几种种高高灵灵敏敏度度方方法法的鉴定都是均一的，那么大致可以认为它是均一的。当然，随随着着更更好好的的鉴鉴定定方方法法的的出出现现，还还可可能能发发现现它它不是均一的。不是均一的。

48、绝绝对对的的标标准准只有把制备物全部结构搞清楚，并经过人工合成证明具有相同生理活性时，才能肯定制备物是绝对纯净的绝对纯净的。生物分子纯纯度度的的鉴鉴定定方方法法很多，常用的有溶溶解解度度法法、化化学学组组成成分分析析法法、电电泳泳法法、免免疫疫学学方方法法、离离心心沉沉降降分分析析法法、各各种种色色谱谱法法、生生物物功功能能测测定定法法，以以及及质质谱谱法法等。生物制药工艺技术基础(3)第二节第二节 微生物制药工艺技术基础微生物制药工艺技术基础、微生物菌种的选育与菌种保藏、微生物菌种的选育与菌种保藏（一）菌种的分离与筛选（一）菌种的分离与筛选1、菌种的分离、菌种的分离 （1）含含菌菌样样品品的

49、的收收集集 根据微生物的生生态态特特点点，从自然界取样，分离取样，分离所需菌种，一般可从土壤中分离土壤中分离。生物制药工艺技术基础(3)（2）富富集集培培养养 收集到的样品若含所需要的菌较多，可直直接接分分离离。若含所需要的菌很少，就需要经经过过富富集集培养培养，使所需要的菌大量生长，以利筛选以利筛选。再配合控制温度、控制温度、pH或营养成分或营养成分即可达到目的。（3）菌菌种种的的纯纯化化 在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生长，所以要进行分离，以获得纯种。菌种纯化的方法一般采用稀释分离法或划线分离法采用稀释分离法或划线分离法。2、菌种的筛选、菌种的筛选 筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的

50、对象筛选的对象。生物制药工艺技术基础(3)（二）菌种的选育与保藏（二）菌种的选育与保藏1、菌株的选育、菌株的选育 发酵生产，从自然界直接分离到的菌种，都不能适合实际生产需要。只有通过诱诱变变、选选育育才能使产量成倍、成百倍成倍、成百倍地提高。（1）自然选育）自然选育 自自然然选选育育是是一一种种纯种选选育育的的方方法法。它利用微生物在一定条件下产生自自发发突突变变的的原原理理，通过分离、筛选排排除除衰衰变变型型菌菌落落，从中选择维持原有生产水平的菌株。因此，它能达到纯化、复壮菌种纯化、复壮菌种，稳定生产的目的。自然选育一般包括单单孢孢子子悬悬浮浮液液的的制制备备、分分离离及及单单菌落培养、筛选