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1、小白鼠染色体标本的制作、染色与观察姓名： 学号：实验时间：1. 实验目的（1） 初步掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法，了解各操作步骤的原理。（2）了解常用实验动物染色体的数目及特点。（3）认识不同生物染色体的特征。2. 实验原理凡处于活跃增殖状态或者经过各种处理，任何动物组织的细胞都可进入分裂时期，均可用于染 色体分析。在正常动物体内，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织。给动物注射一定剂量的秋水仙素， 即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期， 然后采用常规空气干燥法制备染色体， 即可得到大量可分 析的染色体标本。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。骨髓细
2、胞是用于 动物细胞遗传学研究很好的材料。 但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的 精巢为实验材料。对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点：用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤 丝的形成，使细胞分裂停滞在中期，使中期染色体停留在赤道面处；用低渗法使细胞膨胀，以至 于在滴片时细胞胀破，使细胞的染色体铺展到载玻片上；空气干燥法可使细胞的染色体在载片上 展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。Giemsa染色是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。主要用Giemsa染液可以将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。
3、3. 实验材料和用品（1）材料：小白鼠（2）试剂：秋水仙素、生理盐水（0.9%的NaCI溶液）、0.3%KCI低渗溶液、固定液（甲醇：冰醋 酸=3： 1）、Giemsa染液（3）器材：解剖盘、解剖镊、解剖剪、小烧杯（X 2）、吸管、玻璃刻度离心管、恒温水浴锅、离 心机、铜网、预冷载玻片、记号笔、普通光学显微镜、玻璃等4. 实验步骤（1）小白鼠染色体标本制作 取雄性小鼠以每克体重4卩g注射秋水仙素，经1416小时后，断头法杀死小鼠，取出睾 丸用生理盐水（0.9%的NaCI）洗去血污。 放入装有1ml 0.3%KCI液的小烧杯中剪碎至呈乳白色。 用铜网过滤到刻度离心管中，再加 0.3%KCI液至4
4、ml。 37 C静置30分钟，进行低渗处理。 以8001000转/分离心8分钟。 弃上清液，加入2ml甲醇冰醋酸固定液（3： 1），并用吸管至管底吹气，轻轻打散细胞， 固定8分钟。 再以8001000转/分离心8分钟。 弃上清液，加1ml固定液，再制成细胞悬液，固定 5分钟。 取洁净的低温预冷载片，距载片1015cm高度滴下23滴细胞悬液，从载片一边向另一边 轻轻吹气，并同时轻轻敲打载片，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。 用滤纸擦去载片上多余液体，空气干燥或成文火干燥。(2) 小白鼠染色体标本染色与观察 倒置染色法在玻璃板上用废旧载玻片作支架， 使标本载玻片的标本面向下放置到支架上， 在玻璃
5、板和标本载玻片之间滴加 Giemsa染液。目的一可以节省染料，二可以避免染液快速挥发， 三可以防止染色颗粒沉淀，影响观察。 在操作时应注意，多个样品同时染色应摆放紧密，不要有间 隙；滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。 用Giemsa染色2030分钟，细水冲洗玻片背面，去多余染液，气干。 镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数。5. 实验结果此图是经秋水仙素处理的小鼠精细胞染色体标本照片 ,数数发现有 36条染色体而非 40条，可 能是应为染色体重叠程度太高而造成计量误差。视野中可见大量的精子， 它们有一个比较圆的头部和鞭毛， 还有一
6、些细胞有一个尖， 那是未变 形的精子。部分细胞处于减数第一次分裂中期，这样的细胞是二倍体，应有 40条染色体；有些处 于减数第二次分裂中期，这样的细胞是单倍体，应有 20条染色体。还有一些细胞处于分裂期，但 不是中期， 这类细胞染色体的凝集程度不是很高， 呈丝状。 处于减数分裂中期的染色体染色质凝缩 程度达到最大。小鼠的染色体多为端着丝粒染色体，呈“ V'字形或“ U'字形，染色体呈短棒状。6. 讨论与结论(1) 向小鼠腹腔注射秋水仙素时，用左手抓住小鼠背部的皮，右手持注射器，进针时倾斜45°， 在开始注射前， 将针头略向上挑， 以免将秋水仙素注入小鼠的肠道内。 注射
7、过程中注意观察小鼠的 反应。如果秋水仙素被正确注入腹腔内，小鼠应该是很安静的。(2) 断头法处死小鼠后，血液要冲洗干净，以免影响实验观察。(3) 从开始加入0.3%KCI低渗溶液第一次离心前，时间最好控制在 50-60min。过滤出来的如果不 是乳白色悬浊液就再过滤一次。(4) 两次离心的转速控制在 8001000转/分，不要太高，以免破碎细胞。第一次离心去上清液加 固定液时时不要过分吹打，第二次离心后要充分将细胞吹开。( 5 )滴片时，使滴管与载玻片间的距离尽量远，这样细胞才能被“摔碎'，这一点十分重要，从实验结果看来，低渗使细胞破碎效果并不佳，通过摔碎细胞，让染色体更容易辨认，否则
8、，细胞整个 将成蓝色圆状，而膜内物质看不清。(6) 滴完片之后，将载玻片的一端轻轻在试验台边缘敲打，使未破碎的细胞破碎。(7) 边敲打载玻片边从载玻片一边向另一边轻轻吹气，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。(8) 多个样品同时进行染色时，载玻片应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量慢，不要有气 泡，以免部分染色体不被着色。染色时间 30分钟左右。( 9)冲洗载玻片时从背面冲洗。(10) 已知小鼠染色体的数目为 40条，如果实验所得结果远小于这个数值，分析原因可能有二： 在滴片、染色、冲洗等步骤中操作不当，造成染色体丢失；该细胞处于第二次减数分裂中期， 染色体总数为20。染色体重叠程度太高而造成计量误差。(11) 不同动物的染色体条数：猫 38，小鼠 40，大鼠 42，兔44，人 46，马64，鸡 78，狗78。(12) 染色体有三个重要特征：数目；形态(主要是着丝点位置，有中部、亚中部、端部、亚 端部);大小(相对长度)。生物分类时，先观察染色体条数，再观察染色体形状，从而判断生 物种类。(13) 凝集素(PHA有促凝集和促分裂两个作用。(14) 在20对小鼠染色体中，有18对染色体的着丝点是端着丝点，染色体呈“ U'或“V'型，第 17、 18 对染色体有一点小短臂。(15) 冷的载玻片可以起到减小表面张力的作用，铺散细胞。