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1、端粒酶在肿瘤诊断中的应用【摘要】 端粒酶(TR)是合成端粒重复序列的反转录DNA聚合酶，在许多肿瘤组织细胞中处于高度表达活性，而在正常组织细胞中却没有酶活性表达(除生殖和造血干细胞外)。它存在于肿瘤发生、发展过程中，维持肿瘤细胞的高度增殖，对肿瘤细胞端粒的缩短起着非常重要的作用，TR表达水平的高低与肿瘤细胞侵袭、肿瘤进展和转移相关。因此可作为早期诊断肿瘤的广谱肿瘤标志物。 【关键词】 端粒酶；端粒酶活性；肿瘤；肿瘤诊断 端粒酶(telomerase,TR)是使端粒延伸的反转录DNA合成酶，由RNA和蛋白质组成的核糖核酸-蛋白质复合物，以其RNA组分为模板，在TR逆转录酶(TERT)作用下，以3
2、末端为引物，合成端粒重复序列。已证实TR存在于绝大部分正常人体细胞和良性肿瘤组织细胞中，其TR活性均为阴性(生殖细胞除外)。但在人体恶性肿瘤组织细胞中TR活性广泛表达，且活性较高，在恶性肿瘤细胞中表达率占80%90%。TR不仅与恶性肿瘤的发生发展关系密切，而且在一些前侵袭性病变(如发育异常、原位癌)TR活性表达的频率也很高，表明TR激活是肿瘤多步骤形成过程中的早期因素12。大量的研究结果证明TR在肿瘤细胞增值中起着重要的作用，因此可作为恶性肿瘤重要的标志物之一3。在临床上以TR活性水平作为肿瘤诊断的生物标志物和肿瘤化疗指标及预后已越来越受到关注，现综述如下。 TR与肿瘤的关系 恶性肿瘤细胞可大
3、量表达TR，维持染色体的端粒从而稳定着细胞的复制循环。人类肿瘤及肿瘤细胞系研究表明TR活性对于永生性肿瘤细胞生长起到关键作用。在18种肿瘤细胞培养体系中，100株永生细胞系有98株表达TR活性1。TR在人体肿瘤中的表达是在卵巢癌中首次得到证实，继而约在多种人类肿瘤的约85%样本中发现，例如乳腺癌(93%)、原发性肺癌(80%)、胃癌(85%)、脑癌(66%94%)、血液肿瘤(67%100%)和子宫内膜癌(95%)等。正常体细胞大多未见TR活性，仅胚胎细胞、男性生殖性细胞、造血干细胞有表达。因此对组织或细胞内的TR活性检测及其意义已日益受到肿瘤临床的高度重视，对于肿瘤的早期发现及诊断和作为肿瘤的
4、放疗和化疗指标都有着十分重要的意义。近期国内外学者用TR抗原冲击树突状细胞(dendritic cell, DCs)用于肿瘤免疫治疗已取得初步成功46，有望为肿瘤的治疗提供新的手段。2 TR活性检测在肿瘤诊断中的应用2.1 TR在肝脏肿瘤和膀胱癌诊断中的应用对TR大量的研究结果表明在肿瘤细胞中检测到较高水平活性TR，而在激活是多数恶性肿瘤发生的先决条件之一，证实TR在恶性肿瘤组织及相关脱落细胞中检出率很高，因此可作为肿瘤早期诊断的标志物。在慢性肝病和肝肿瘤中TR的表达程度的研究中，TR的表达活性在肝癌的发展中起决定性的作用，其表达活性在慢性肝病和肝癌患者分别是55%的弱阳性和85%的强阳性7。
5、Nouso等8在对10例肝癌患者肝组织针取活检标本中进行TR活性检测, 结果TR阳性率为80%(8/10), 和手术标本组织中TR阳性率87%(20/23)比较差异无显著性。表明检测针取活检组织中TR活性可作为肝癌的早期诊断。Kinoshita等9比较了TR活性检测和癌细胞脱落细胞学检查在肿瘤诊断的应用中，结果为肿瘤组织样品中、膀胱冲洗液、随意尿液中TR检出率分别为98%(41/42)、84%(36/43)、55%(23/42)。而45例膀胱癌尿脱落细胞学检查仅42%检出癌细胞，无肿瘤患者的膀胱冲洗液未检出TR。级肿瘤患者的尿液和冲洗液脱落细胞TR检出率为75%(9/12)，级为96%(27/
6、28)；而细胞学检出癌细胞率级为8%(1/12)；级为46%(13/28)。结果表明TR活性检测癌症的敏感性显著高于细胞学检查，对膀胱癌的早期诊断和预后有着十分重要的作用。2.2 TR在妇科恶性肿瘤和前列腺癌诊断中的应用在140例外科切除的乳腺患者中有93%患者检测到TR活性的表达，在乳腺癌期患者中有68%表达TR活性；在肿块<20 mm的患者中73%的患者组织内有TR活性表达；81%的淋巴结TR检测结果是阴性的肿瘤患者中，后期有95%的患者乳腺组织中出现TR的表达10。另项研究发现在多种妇科恶性肿瘤TR阳性率达95%以上，而在正常对照组织或良性妇科肿瘤中均为阴性11。Hess1
7、2等研究发现在肿瘤患者的腹水、胸腔积液、盆腔冲洗液、支气管冲洗液、尿液或膀胱冲洗液中均发现TR活性。最近报道对50例妇科恶性肿瘤腹腔液癌细胞TR活性检测总阳性率为74%(34/50)，而细胞学检查总阳性率仅为46%(23/50)，两者差异有显著性，结果表明TR活性检测比细胞查更为敏感，尤其是细胞学检查阴性的病例13。同年另项研究结果表明,在45例卵巢癌中TR活性阳性率为82%(37/45)，进一步证明TR活性随着卵巢癌病理学分级增加而增高P0.05，差异有极显著性；临床分期与TR活性比较差异也有显著性(P0.05)；并且和盆腹腔淋巴结转移之间存在正相关，提示TR阳性是判断卵巢癌恶性程度和有无转
8、移的重要的客观指标，对卵巢癌的诊断、治疗和预后判断具有重要的指导意义14。在良性前列腺增生组织中TR活性检测呈阴性，而前列腺癌患者中84%为强阳性；而肿瘤周边组织中TR活性表达为弱阳性的占12%；16%的肿瘤转移患者的淋巴结中TR活性表达都是强阳性；高水平TR活性在分化差的前列腺癌中更为常见。因此TR活性检测可作为乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的诊断指标。2.3 TR在肺癌及其恶性胸腔积液诊断中的应用TR活性不仅在肺癌组织中有较高的表达(87%)，而且在肺癌患者外周血中癌细胞也有TR活性的表达(60%)，良性肺部肿瘤则表现为较低活性。因此检测肺癌患者外周血癌细胞及微转移对于早期诊断、指导治疗判断预后
9、甚为有着重要的意义15。在94例各种恶性肿瘤组织与恶性胸腔积液和腹水TR活性总检出率为89.4%，其中5例胸腹膜转移癌的胸腔积液和腹水检出率为80%，58例肿瘤远端组织与良性胸腔积液和腹水的检出率为8.6%。经统计学处理差异有显著意义(P0.01)。5例恶性胸腔积液和腹水患者经临床和影响学证实均为恶性肿瘤伴胸腹膜转移，该5例胸腔积液和腹水常规检查为渗出液，细胞学检查为阴性，但经两次以上取胸腔积液和腹水重复测定证实4例TR检测阳性，良性胸腔积液和腹水均未检出TR活性16。因此，用于肿瘤组织测定具较好的敏感性与特异性，可用于良恶性胸腔积液和腹水的鉴别诊断。近期对肺癌手术前后患者外周血中癌细胞TR活
10、性检测的研究中，结果表明非肿瘤患者外周血TR活性均为阴性，肺癌患者手术前后外周血TR活性分别为60%和50%，提示相当多肺癌患者外周血存在一定数量的肿瘤细胞，部分患者外周血存在微转移可能；手术切除后有83%(15例)阳性患者TR活性明显下降(P0.01)，差异有显著性，表明手术治疗肺癌可在切除原发肿瘤同时减少外周血中肿瘤细胞数量，降低转移率，并且发现手术后TR活性明显降低者有较好的预后，升高者预后不佳17，总之，手术前后外周血TR活性的测定可作为预测肺癌患者手术疗效的一个重要指标。肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，由于其临床表现无特异性，早期诊断较为困难，为了早期对肺癌的诊治，国内学者刘先军等18采
11、用诱导痰技术获取肺癌痰标本并检测其TR活性，通过TR活性半定量分析发现，肺癌患者的痰液和诱导痰中TR活性平均水平明显高于对照组；进一步说明痰液中TR活性的表达水平与肺癌之间有比较明显的相关性；同时还发现肺癌患者诱导痰中TR活性检测阳性率达，明显高于常规痰标本的阳性率。因此该方法对肺癌的诊断及鉴别诊断具有较高的临床价值，此方法具有取材方便和无创伤性等优点，适用于肺癌的普查及早期诊断。2.4 TR在皮肤癌和甲状腺癌诊断中的应用在皮肤领域中的研究发现TR与正常皮肤的生长、皮肤肿瘤和炎症性皮肤病有一定的关系。发现在皮肤基底细胞癌(73/77)、非转移性皮肤鳞癌(15/18)及皮肤黑素瘤(6/7)中TR
12、水平远高于未受阳光照射的正常皮肤；受阳光照射的皮肤、银屑病病损皮肤和有毒常青藤诱发的皮炎中的TR水平比肿瘤组织低，但高于正常皮肤组织19。另项研究发现TR不仅存在于皮肤恶性肿瘤(91%)还存在于恶变前皮肤肿瘤(89%)，并认为TR的激活在皮肤肿瘤中起着重要作用20。TR在甲状腺癌诊断中的研究表明，TR活性不仅在甲状腺癌中高表达，而且与癌的甲状腺外侵犯、Ki67标记指数及低分化密切相关，认为TR活性的检测在临床估计肿瘤进展和预后方面有很大的应用潜力。Umbricht21等认为，对于组织和细胞病理学不易区分的滤泡性甲状腺癌和滤泡性甲状腺腺瘤来说，TR活性是很好的鉴别标志物；研究发现100的滤泡性甲
13、状腺癌有TR活性表达，而良性滤泡性甲状腺腺瘤的阳性率只为19，癌旁的正常甲状腺组织则无TR活性。由于TR活性检测具有高度的特异性和敏感性，适用于术前组织FNA标本，有希望作为早期病例的筛查手段。2.5 TR在直肠癌诊断中的应用直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤，至今尚没有找到理想的诊断和预后标志物。近期报道22采用端粒重复序列扩增法(PCR)及免疫组化法对大肠癌、癌旁、正常大肠黏膜及腺瘤性息肉组织的TR活性和TR催化亚基(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)表达的研究表明，TR活性和hTERT在大肠癌组织中的表达率明显升高；低分化大肠癌组织中
14、的TR和hTERT表达率明显高于中分化及高分化大肠癌；伴淋巴结转移大肠癌TR和hTERT阳性表达率明显高于无淋巴结转移者。国外学者研究，发现大部分结直肠癌细胞都显示有TR的活化，而且端粒长度的增加和结直肠癌的不良预后有关。Cristina GarciaAranda23在对91例结直肠癌标本检查后发现81.3%的结直肠肿瘤有TR活性的增高。同时端粒长度增长者预后较差，相对危险度达到6.48。研究小组发现端粒重复结合片断1(TRF1)是结直肠癌的预后指标之一，TRF1过度表达者端粒较短，患者具有较好的预后。笔者推测重要的端粒的缩短能够防止体细胞的分裂，而较长的端粒能够使得肿瘤细胞和干细胞持续分裂。
15、该研究可能在肿瘤细胞TR阳性的患者中，寻找预后相对较好的患者有重要作用。3 TR在肿瘤治疗中的应用 TR广泛存在于恶性肿瘤细胞中并高度表达，因此目前已把TR作为诊断和治疗肿瘤的新靶点并逐渐得到应用。近期郑晓飞等24以TR为抗癌药物作用靶标，建立抗癌药物筛选模型，在9种已知癌症治疗药物和91种化合物种初步筛选到了H9 、H13、 H14 和H30，其在体外可以抑制TR活性，其中H9、 H13和H30 对培养的HeLa细胞生长具有抑制作用，且有一定的剂量依赖关系，表明该类化合物具有抗癌的潜力。钟济华25在以阿糖胞苷(AraC)为诱导剂，检测了不同浓度、不同时间AraC作用HL60细胞TR各组分基因
16、mRNA水平的变化，结果表明AraC下调hTERT基因的mRNA水平和TR组分基因hTERTmRNA水平，和对照组比较差异有显著性。提示TR可作为抗癌药物用药和评价化疗药效的依据。目前，国外以TR抗原冲击DCs用于肿瘤免疫治疗已取得初步成功，国内屈艺6率先进行TR抗原冲击DCs用于前列腺癌免疫治疗的研究，提示将负载TR抗原的DCs回输体内，可望在体内诱导出肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，以特异性杀伤前列腺癌细胞，用于前列腺癌的免疫治疗。近年已见利用TR特性研究基因的报道有望能成为治疗肿瘤的新方法26。 综上所述，TR的发现、TR假说已被越来越多的研究所证实，不仅在理论上丰富和发展了分子
17、肿瘤学理论，而且在实践上也为肿瘤的诊断和治疗提供了依据。TR检测方法已经广泛应用于肿瘤诊断、分期、监测疗效和预后等方面显露出很好的优势。检测TR活性成为肿瘤诊断的生物标志物和肿瘤的化疗指标，尤其应用于肿瘤早期诊断和无症状早期肿瘤诊断有着重要作用。 以TR及其调节蛋白为靶点筛选新的抗肿瘤药物，如反义寡核苷酸、核酶、核苷类似物蛋白激酶C抑制剂、细胞分化诱导剂等。研究表明TR抑制剂不但可以直接抑制肿瘤细胞生长，还可以提高肿瘤细胞对破坏DNA抗癌药的敏感性极对凋亡的感受体，与手术及药物治疗肿瘤有协同作用，且对表达TR活性的正常细胞无明显副作用。有望成为一种很有前景的治疗肿瘤的新靶点。 端粒危机假说，缩
18、短的端粒和激活的TR对于染色体的克隆化是必须的，如果药物抑制了TR的活性，端粒危机机制无法启动，那么克隆繁衍也就随之消失，肿瘤发展也就减缓或停止。今后对人类TR蛋白成分的基因编码及结构进行研究、TR抑制剂的研究，在分子水平上对人类TR蛋白的编码基因进行分离鉴定，为肿瘤的治疗提供新的方法。【参考文献】 1Kim NW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancerJ. Science,1994，266:20112014.2Shay J W, Wright WE. Telomerse
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